细胞化学元素合集12篇
细胞化学元素篇1
在青年教师汇报课的教学活动中，我积极参加了这项学校活动，在准备期间我学到了很多东西，现总结如下：
《细胞中的元素和化合物》是人教版教材高一生物第2章第1节的内容，也是刚上高中的学生面对的学习内容，在初中生物知识的基础上，学生再通过本章节的学习，就会对细胞的知识有全新的认识。通过已学过的化学知识自然地过渡到细胞是由哪些化学元素和化合物组成，这样就对本节课的接受提供了帮助。教材的地位本节的内容可以为本章后几节中具体学习细胞中的各种化合物作铺垫，因此这节内容在本教材中，乃至整个高中生物与初中生物的衔接上都起到了一个承上启下的作用。教学目标设置是根据本教材的结构和内容分析，结合高一年级学生的认知结构及其心理特征，知识与技能是简述组成细胞的主要元素。说出构成细胞的基本元素是碳。说出细胞中主要化合物的种类。简述检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的方法。过程与方法通过分析岩石圈与人体部分化学元素的含量表，培养学生读表格及简单的数据分析能力。通过分析组成人体细胞的主要元素占细胞鲜重、干重百分比图，培养学生的读图能力。通过检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的实验，培养学生实验分析及实验操作的能力。情感态度与价值观方面侧重培养学生认同生物界在物质组成上的统一性，崇尚生命物质的和谐之美，珍爱生命。
本着高一新生培养兴趣的前提下，在吃透教材的基础上，我确定了以下的复习重点和难点是组成细胞的主要元素和化合物；检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质。为了讲清教材的重、难点，使学生能够达到本节内容设定的教学目标，我设置的教法是在新授课过程中，考虑到我校为普通校高一年级学生的基础差，听课注意力不集中的现状，我主要采取师生问题衔接法、活动探究法互动的教学方法，激发学生对解决问题的渴望，让学生真正被吸引而参与其中得到自信。同时也体现了课改精神。问题衔接法是针对学生基础现状，设置一系列问题串的形式，利用多媒体一个一个给出，学生回答出一个问题，教师从中再设置疑问再引导思考，最后所有问题都展示出来，可以一直吸引学生，解决我校学生由于学习习惯不佳、听课不集中的问题。活动探究法内容是结合白板给出一些图表数据，提出思考问题，组织学生以小组为单位讨论，培养学生的团结协作精神，以学生为主体，使学生的独立探索性得到了充分的发挥，培养学生的自学能力、思维能力和语言表达能力。由于本节是新授课，学生需要老师不断地提示和引导，教师要充分发挥“扶”而不代替的度，并及时鼓励学生，这样有利于调动学生的积极性，发挥学生的主体作用，让学生对本节知识的认知更清晰、更深刻。我们常说：“现代的文盲不是不识字的人，而是没有掌握学习方法的人。”因而，我即便在新授过程中也特别重视学法的指导。对于高一的学生而言，有了初中的认知，所以面对本节中的元素和化合物种类的介绍并不难，可是本节课的内容涉及很多数据表格、统计图的阅读和分析，学生在分析统计结果时往往没有良好的习惯，不能科学分析和归纳，因此在教授时可以充分利用这些统计图、表格，系统地培养学生读图、表的能力，建立科学生物学实验数据的分析方法。
在这节课的教学过程中，我注重突出条理清晰，紧凑合理。各项活动的安排也注重互动、交流，最大限度地调动学生参与课堂的积极性、主动性。复习旧知识引入新课。直接回顾两个问题，通过答案引入新课，我这样设计的目的让学生明白本节知识的由来和节与节之间的联系，培养学生的章节联系能力。授课在开始时，讲解新课前在多媒体上明确这一节的学习目标。我这样设计是为了培养学生听课时有目标的学习，对于高一学生，尽快养成有效率的听课习惯。之后，对比表格，学生回答三个问题：科学家将地壳与细胞中主要元素含量进行分析，教师指导学生从表头分析，先纵后横阅读，锻炼学生对比数据的能力。当学生逐渐找出元素种类相近统一性，含量不同差异性后，那么在我们人体细胞主要有哪些元素呢？分析表格，思考，在教师提示下发现规律，并在老师的引导下发现了生物界起源于非生物界。我这样设计是为了培养学生对生物界与非生物界关系的了解，渗透德育，生命是物质的，生命起源的神奇。细胞中的元素组成阅读教材或屏幕展示图2-1，图2-2，这样设置是针对学生的基础现状用问题衔接法，设置一系列问题串的形式，利用多媒体一个一个给出，学生回答出一个问题，教师从中再设置疑问引导思考，最后所有问题都展示出来，带动学生思考的积极性，逐渐锻炼学生的图文转换能力来适应高考能力要求，也通过问题环环相扣的方法，有效解决我校学生由于学习习惯不佳、听课不集中的问题。同时德育引导学生思考逐一问题，在提示中，慢慢帮助我们普通校的学生找到学习的快乐和自信。接下来通过多媒体展示资料，提问：微量元素是不是可以没有？同时可以举出很多微量元素的作用，比如铁、锌、碘、硼，此时的学生兴奋点很高，及时引导学生德育，不要挑食，要理性健康选择食物，健康成长。提示学生在学知识的同时明白了很多生活常识，暗示德育生活是有科学奥秘的，学以致用，学生会很高兴，对生物很有兴趣。细胞中的化合物结合教材谈一下化合物的分类。学生结合教材将无机物两类和有机物四类说出。问题虽简单，却可以引导学生看教材的能力，及时鼓励增强他们的自信心。实验时间12分钟左右，指导学生实验，分成几个小组，明确实验材料和实验步骤，同时提出问题：还原糖的鉴定可以用西瓜汁吗？斐林试剂与双缩脲试剂的不同在哪？这个环节设计的目的是锻炼学生的动手能力，及时鼓励学生，引导学生生物的奥秘，让学生陶醉在这个学科里。做完试验及时整理德育养成好习惯，渗透环保意识。课堂小结及练习让学生谈收获的设计目的是让学生有及时总结的好习惯，出示由简到繁的几道练习题，指导学生边做边回顾这一节的知识点。德育也鼓励学生很出色，告诉学生学习生物是快乐的，这个学科可以教会很多健康知识、动手能力。布置作业，针对学生素质的差异，我进行了分层次的习题训练，整理笔记。这样做既可以使学生掌握基础知识，又可以使学有余力的学生有所提高。
在这节课的教学过程中，我设计时注重突出条理清晰，白板、黑板与学案的紧凑合理。各项活动的安排也注重互动、交流，最大限度地调动学生参与课堂的积极性、主动性。新授课我采用由简到繁问题衔接法和小组讨论法，再师生讨论的动手实验法，以“教师为主导，学生为主体”，教师的“导”立足于学生的“学”，以学法为重心，放手让学生主动地参与到知识形成的整个思维过程，力求使学生在积极、愉快的课堂氛围中提高自己认识水平的同时，给予学生更多的德育，比如爱心、热心、自信心的培养，现在看来，在我们师生的共同努力下基本达到预期的教学效果，但课后思考发现还有很多不足之处，比如，在学生讨论合作解题环节，时间有些长，使后面的习题训练环节没有全部完成，最后总结让更多的学生都谈收获会更能调动学生的学习积极性。不成熟之处还有很多，我以后会更加努力钻研业务和认真学习！
细胞化学元素篇2
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（b）-0017-04
[Abstract] Objective To study the repair effect of gastrodin on hypoxic brain neurons damage induced by cobalt chloride in rats， and provide an experimental reference for clinical treatment of ischemic and hypoxic brain damage. Methods Cerebral cortex nerve cells of SD rats were selected for study. The original generation after 7 d， they were numbered according to the culture dish. Primary cells were divided into blank control group， model group， gastrodin group and gastrodin control group by using random number table method， and corresponding treatment was implemented. Cell morphology， neurons relative vigor， lactate dehydrogenase （LDH） release quantity， EphA4 expression difference among four groups were observed. Results The relative activity of neurons in blank control group was significantly higher than that in other groups， the relative activity of neurons in model group was significantly lower than that in gastrodin group and gastrodin control group， the relative activity of neurons in gastrodin group was significantly lower than that in gastrodin control group （P < 0.01）. The neurons LDH activity of model group was significantly higher than that of other groups， the neurons LDH activity of gastrodin group and gastrodin control group were significantly higher than those of blank control group （P < 0.01）. The average neurons IOD of model group was higher than that of other groups， the average neurons IOD of blank control group was lower than that of other groups （P < 0.01）. Conclusion Gastrodin can reduce the expression level of EphA4 in the injured neuron， inhibit the activity of LDH in neuronal cells， and enhance the cell relative viability， has a positive effect on the protection of rat cortical neuronal injury， is worthy of further study.
[Key words] Gastrodin； Cobalt chloride； Cortical neuron injury； Nerve protection； Hypoxic ischemic brain damage
缺血缺氧性脑损伤的病理过程包括能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸分泌过多及一氧化氮蓄积等，上述病理反应引发的级联细胞毒作用是诱发神经元损伤的主要原因[1]。目前已有大量西药相继应用于神经元损伤的预防及治疗，其临床效果得到了一定认可，但伴随而来的明显副作用大大限制了其应用前景[2]。天麻素的强效镇痛、镇静、心血管功能改善、抗炎及抗自由基作用已被广泛证实，研究表明，天麻素还具有增强血管顺应性作用，有望改善脏器缺血缺氧状态、发挥脑保护作用[3]。本研究就天麻素对神经元损伤的影响进行实验分析。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物：出生24 h内健康新生SPF级SD大鼠，由郑州大学医学院动物实验中心提供，动物合格证号：120000KXWQR08001。
主要药品：天麻素（昆明制药集团药物研究所生产，100 g/瓶，批号：20130115，分析纯），纯度99.5%，分子量286.27，其化学结构式如图1所示。
主要试剂：Neurobasal培养基（美国Gibco公司生产）、B27试剂（斯百汇生物科技有限公司，规格：10 mL）、胎牛血清（美国Gibco公司生产，规格：500 mL）、胰蛋白酶（苏州亚科科技股份有限公司，型号：9002-07-7）、多聚赖氨酸（上海宝曼生物科技公司，浓缩液，25 mg/瓶）、氯化钴（CoCl2，山东淄博润兴化工厂生产，分析纯）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2、5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（美国Sigma公司，分析纯）、乳酸脱氢酶（LDH）定量检测试剂盒（美国罗氏公司）、抗鼠人肝癌细胞系A4（EphA4）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）、CY3荧光试剂盒（武汉博士得生物制品公司），其他试剂均为进口分析纯。
1.2 处理方法
1.2.1 大鼠皮质神经元细胞原代培养 使用75%乙醇消毒实验大鼠，在严格无菌条件下，行神经元细胞原代培养[4]，持续7 d。
1.2.2 细胞分组及处理 将原代培养7 d后的细胞按照培养皿编号，使用随机数字表法分为空白对照组、模型组、天麻素组及天麻素对照组，以125 μmol/L CoCl2溶液处理模型组及天麻素组细胞4 h，然后以25 mg/L天麻素处理天麻素组、天麻素对照组细胞24 h[5]。
1.3 观察指标
1.3.1 神经元形态观察 于倒置显微镜下，对各组细胞神经元形态变化进行拍照、观察，并比较。
1.3.2 细胞相对活力检测 采用MTT法，对各组细胞相对活力进行检测[6]，使用全自动酶标仪，检测其570 nm波长处吸光度（OD）值。
1.3.3 LDH活性检测 LDH活性检测采用速率法[7]，检测其440 nm波长处OD值。
1.3.4 EphA4表达量检测 采用细胞荧光化学法，对各组细胞EphA4表达量进行检测[8]，红色荧光即为免疫阳性细胞。使用Image-Pro Plus 6.0软件，对各实验组的荧光图片单个细胞的累积吸光度（IOD）值和平均IOD值进行分析并比较。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 神经元形态
倒置显微镜观察结果示，空白对照组神经元形态均匀一致，大小相仿，胞体饱满，呈光滑的椭圆形或锥形，神经元的突起广泛分枝，相互交叉，折光性强；模型组神经元形态发生明显改变，细胞折光性下降，胞体萎缩，出现颗粒，轴突变细变短，形状僵硬，分枝减少；天麻素组神经元形态较模型组有所改善，胞体萎缩减轻，轴突保留较多，但仍有少数细胞坏死；天麻素对照组形态较对照组稍差。见图2。
2.2 细胞相对活力
空白对照组神经元细胞相对活力显著高于其他各组，模型组神经元细胞相对活力显著低于天麻素组、天麻素对照组，天麻素组神经元细胞相对活力显著低于天麻素对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。
2.3 LDH活性
模型组神经元细胞LDH活性显著高于其他各组，天麻素组、天麻素对照组神经元细胞LDH活性显著高于空白对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图4。
2.4 EphA4表达
荧光显微镜观察结果示，各组神经元胞体、突起均可见红色荧光显示，但各组荧光强度存在一定差异。模型组神经元平均IOD值显著高于其他各组，空白对照组神经元平均IOD值显著低于其他各组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图5和图6。
3 讨论
缺血缺氧性脑病存活患者病残率高达75%，这与脑组织缺血缺氧引发的神经细胞死亡，继而导致的神经功能缺损具有密切关联[9-10]。因此，临床亟需一种能够有效保护神经元功能、避免神经元损伤的药物。
天麻素是我国传统中药材天麻中的主要有效成分，已有大量研究证实，天麻素具有恢复大脑皮质兴奋与抑制过程间平衡失调等作用[11]。研究表明，天麻素还可通过抑制兴奋性氨基酸诱导的细胞凋亡过程，在清除自由基、对抗自由基诱导的细胞损伤、神经保护等方面发挥积极效果[12]。本研究结果示，经CoCl2处理后，模型组、天麻素组神经元细胞均出现了不同程度的形态学变化，以胞体萎缩、细胞坏死为主，说明天麻素具有一定的神经保护作用。
在天麻素神经保护作用机制的研究中发现，模型组神经元细胞相对活力最低，但其LDH活性最高，说明模型组神经元细胞存在明显损伤，而天麻素在一定程度上使CoCl2诱导的化学性损伤得到抑制，考虑与天麻素在对抗兴奋毒性、双向调节一氧化氮和一氧化氮合酶、促进胶质细胞产生营养因子、稳定胞膜、抗细胞氧化等方面发挥的积极作用有关[13]。大量LDH的漏出表明，神经细胞膜完整性受损，且Cai等[14]研究证实，LDH活性与神经细胞损伤程度呈正比，故本研究结果示，天麻素处理后神经细胞LDH漏出量显著降低，提示天麻素对细胞膜完整性的维持亦具有一定作用。
此外，本研究发现，经CoCl2处理后，模型组细胞EphA4表达水平显著升高，而天麻素可使细胞EphA4表达水平得到明显控制，与何保丽等[15]研究结论一致。作为一种具有影响突触可塑性的基因，EphA4广泛分布于大脑各个区域，并集中于海马锥体细胞树突棘部位，研究表明，配体Ephrin-A3可激活EphA4，诱发下游信号转导级联瀑布，导致树突棘瓦解，使成熟大脑突出的重构能力得以保存[16-18]，因此，EphA4在缺血缺氧损伤后神经元的损伤中扮演了重要角色。本研究天麻素组细胞EphA4表达得到有效抑制，说明经天麻素处理后，EphA4参与的CoCl2诱导神经元损伤过程得到了有效控制，细胞自我保护现象有所降低，神经元重构能力得以保存，从而有效延缓了神经元损伤过程[19-20]。
综上所述，天麻素能够有效抑制CoCl2诱导的大鼠皮质神经元损伤，其保护作用可能与EphA4表达抑制有关，为缺血缺氧性脑损伤的临床治疗开拓了新的研究方向，但其具体作用机制有待进一步深入观察。
[参考文献]
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细胞化学元素篇3
College of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China; Department of Nutrition and Food Hygene， 3rd Military and Medical University; College of Food Science， Southwest University
Abstract：Objective To investigate the effect of Kudzu flavonoids extracts on human leukaemia cancer cells HL60 line to reveal its probable mechanism. MethodsThe survival and proliferation of HL60 cells were determined by MTT.The cellDNA ploidy distribution and apoptotic rate were measured by flow cytometry (FCM)， and DNA ladder.The differentiation induced potence was determined by NBT. The anticancer and apoptosis potence induced by flavonoids detected by TUNEL. ResultsThere was significant inhibition of the cel1 surviva1 and proliferation of cancer cells by the extracts. An apoptosis peak appeared after treated with 3d and apoptotic rate was 38.3％， morphological change and DNA ladder of apoptosis was observed. Kudzu flavonids showed weak potent to induce differentiation. Daidzein and puerarin which regard as Kudzu flavonoids main effect ingredient have weak apoptosis induced potent， but daizein showed strong differentiation induced potent. ConclusionKudzu flavonoids could significantly inhibit growth of human leukaemia cancer cells HL60 line through inducing apoptosis.
Key words：Kudzu；Flavonoids extracts；Apoptosis；Differentiation
摘要：目的观察葛根黄酮提取物对HL60细胞的影响及作用机制。方法用MTT测定对HL60细胞增殖的影响；用流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡情况；采用NBT比色法检测诱导HL60细胞分化的能力；DNA Ladder检测HL60细胞的凋亡特征及效果；用TUNEL检测体内诱导凋亡能力。结果葛根黄酮提取物有较强抑制HL60细胞生长和增殖能力，处理3d可出现明显的凋亡特征，凋亡率可达38.3%，其诱导分化能力弱，葛根黄酮提取物的主要成分葛根素和大豆甙元的诱导凋亡能力弱，但大豆甙元具有较强的诱导HL60细胞分化的能力，葛根黄酮提取物有体内诱导凋亡抗肿瘤能力。结论葛根黄酮提取物可通过诱导细胞凋亡抗人白血病HL60细胞的生长。
关键词：葛根；黄酮提取物；凋亡；分化
0引言
葛根为常用中药，是豆科植物野葛[Pueraria lobata(Willd.)Ohwi]和粉葛(Pueraria homsonii Bentn)的肥大块根，在我国除新疆、青海及西藏外遍布全国各地。葛根中除含有约占新鲜葛根19%~20%的葛根淀粉外，主要成分为异黄酮化合物以及少量黄酮类物质，其中大豆甙元、大豆苷、葛根素是葛根的主要活性成分，尤以葛根素含量最高。近年来研究发现葛根黄酮提取物有抗氧化、抑制癌细胞增殖、诱导黑色素瘤和肝癌细胞凋亡等抗肿瘤作用[13]，但葛根黄酮提取物抗肿瘤的机制及主效成分还未得到揭示。本实验以人白血病HL60细胞为研究对象，研究葛根黄酮提取物抗肿瘤的途径及其抗肿瘤的主效成分，为葛根黄酮提取物开发为抗肿瘤保健食品和药品提供理论依据。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器葛根黄酮提取物（野葛），用乙醇提取，经乙醇沉降、AB8大孔树脂柱层析等得到纯度80％的成品，其中含葛根素25.2％、大豆甙元16.2％、三羟基异黄酮21.9％；葛根素、大豆甙元标准品购自中国药品生物制品检定所；RPMI1640为Hyclone公司产品；TUNEL凋亡检测试剂盒为华美生物工程公司产品；INCO2 108型CO2培养箱（德国）； 流式细胞仪FACS440型（美国）。
1.2细胞培养实验HL60细胞购于中科院上海细胞生物研究所，培养在RPMI1640培养液中，含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，置于37℃、5% CO2细胞培养箱，常规培养传代。待细胞处于对数生长期时进行实验处理。
1.3细胞实验分组及药物处理实验设对照组（control）和葛根黄酮提取物、葛根素与大豆甙元处理组。用二甲基亚砜（DMSO）分别将葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元配成100mg/ml、10-2mol/L、10-2mol/L的储存液，使用液用RPMI1640稀释到所需浓度。DMSO在各组培养液中的浓度均≤0.05％。经预实验确定葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元的处理浓度分别为50μg/ml、30μmol/L、30μmol/L。
1.4MTT比色法HL60细胞以1×105个/ml细胞密度接种于96孔培养板中，每孔200μl，加各处理因素，培养1～3d，收获细胞前4h，每孔加入15μl MTT（5mg/ml），37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养4h，去掉培养液，加入200μl异丙醇、二甲基亚砜混合液（1∶1，v/v）。室温30min左右，用酶联仪在492nm处测OD值。
1.5流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率葛根黄酮提取物处理HL60细胞2d，收获细胞，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）染色，采用流式细胞仪检测细胞周期相分布和细胞凋亡率。
1.6DNA梯形带检测经葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元处理HL60细胞2d后，收获细胞，加入150μl NP40细胞溶破液（1% NP40，20mmol/L EDTA，50mmol/L Tris·Cl pH 7.5）溶破5h，离心收集上清，取上清置于1% SDS溶液中，混匀，加入RNase A至终浓度为2μg/ml，56℃孵育2h，再加蛋白酶K至终浓度为2μg/ml，37℃水浴2h。加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，于-20℃静置，离心获得DNA沉淀。将此DNA沉淀用TE缓冲液溶解取样进行2% 琼脂糖电泳。
1.7NBT还原实验以1×105个/ml的细胞密度，将生长良好的细胞接种于培养瓶中，加处理因素培养3d后，调整细胞浓度至1×106，接种于24孔培养板，加入含1.25mg/ml NBT、17mg/ml BSA以及2μg/ml TPA的PBS缓冲液，37℃培养2h，弃去培养液，加入3ml DMSO溶解结晶物，用酶标仪在580nm处测OD值。
1.8TUNEL凋亡试剂盒检测收获HL60细胞涂片，按凋亡试剂盒的要求进行孵育和染色，光学显微镜进行镜检观察HL60细胞的形态变化，凋亡细胞核染色为棕黄色。
1.9统计学处理实验数据以±s表示，应用The SAS system 6.12统计软件进行统计处理和显著性检验。
2结果
2.1葛根黄酮对HL60细胞增殖功能的影响MTT比色实验显示，葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元处理HL60细胞1～3d后，OD492值分别比对照HL60细胞明显下降，说明葛根黄酮提取物具有较强抑制HL60细胞增殖能力，其次为大豆甙元，葛根素最弱，见图1。
图1葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元对HL60细胞增殖的影响（略）
2.2葛根黄酮提取物对HL60细胞周期相分布及凋亡率的影响HL60细胞经处理后，经流式细胞仪分析，结果显示：随着葛根黄酮提取物处理天数的增加，HL60细胞中处于G2/M期的细胞数显著增多，S期细胞数减少，细胞凋亡率显著增加；随着葛根素和大豆甙元处理天数的增加，HL60细胞中处于G1/G0的细胞数增加，S期和G2/M细胞数减少，细胞凋亡率增加，见表1、图2。由此看出葛根黄酮提取物可阻滞细胞周期于G2/M期，有较强的诱导HL60细胞凋亡的能力，其诱导凋亡能力强于葛根素和大豆甙元。葛根素和大豆甙元阻滞细胞周期于G1/G0期，大豆甙元对HL60周期阻滞能力和诱导凋亡能力强于葛根素。
表1葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元对细胞周期分布和细胞凋亡的影响（略）
与对照组比P
图2流式细胞仪分析各处理组HL60细胞周期相分布的影响（略）
2.3葛根黄酮提取物对HL60细胞凋亡的DNA Ladder检测HL60细胞经处理后其细胞凋亡百分率增加（流式细胞仪检测结果），进一步通过DNA Ladder分析其凋亡能力，结果发现：正常HL60细胞其DNA在凝胶上电泳痕迹为积聚状，而葛根黄酮提取物处理HL60细胞后其DNA在凝胶上电泳痕迹为梯形状，随着处理天数的增加梯形带越明显，见图3。葛根素和大豆甙元处理后得到HL60细胞DNA Ladder不明显（图略）。说明葛根黄酮提取物诱导HL60细胞染色质DNA进行有控降解，将DNA酶切为由180～200个碱基对或其倍数的寡核苷酸片断。葛根黄酮提取物诱导HL60细胞凋亡的能力高于其对照品葛根素和大豆甙元。
2.4葛根黄酮提取物诱导HL60细胞分化的能力HL60细胞经处理3d后，收获细胞，测定其NBT还原力，结果显示：经处理后HL60细胞的NBT还原力上调，且表现为大豆甙元的诱导能力强于葛根素，而葛根黄酮提取物的能力最弱，见图4，说明葛根黄酮提取物的诱导分化能力最弱，而大豆甙元具有强的诱导分化能力。
图3DNA 梯形带检测葛根黄酮处理HL60细胞诱导凋亡能力（略）
* 与对照组比P
图4葛根黄酮提取物诱导HL60 细胞分化能力（略）
2.5诱导凋亡的原位检测葛根黄酮提取物有诱导HL60细胞凋亡的能力，见图5。对照组肿瘤细胞体积较大且胞浆丰富，鲜见染色为棕黄的细胞核；随着葛根黄酮处理HL60细胞天数的增加，呈棕黄色细胞核的细胞数增加，凋亡细胞的体积变小，胞核浓缩。葛根素和大豆甙元的诱导凋亡阳性细胞能力弱，原位检测不明显（图略）。
3讨论
葛根黄酮提取物的抗肿瘤功效最早是在1994年见到相关报道，但是葛根黄酮抗肿瘤的作用途径及分子信号途径没有得到揭示。本实验结果说明，葛根黄酮提取物通过诱导凋亡达到抗HL60人白血病的功效。作为葛根主要成分的葛根素和大豆甙元，其诱导HL60细胞凋亡的能力低于葛根黄酮提取物，其中大豆甙元的诱导凋亡能力强于葛根素。由于葛根黄酮提取物中含21％左右的三羟基异黄酮，而三羟基异黄酮是强诱导凋亡的黄酮类化合物[4]，推测葛根黄酮提取物的诱导凋亡能力强于葛根素和大豆甙元与其三羟基异黄酮组分有关。 细胞分化是近年来研究发现的。某些恶性肿瘤在体外可被某些物质诱导分化为具有与它原来生理功能完全相同或几乎相同的细胞，从而为肿瘤的治疗、研究开辟了新的方向[5]。但值得注意的是分化后的细胞不可能恢复其全部而只能恢复其部分正常功能。大豆甙元可以诱导HL60向粒细胞分化，并呈浓度依赖性，分化成熟的HL60细胞具有NBT还原力、非特异性脂酶染色能力及与单克隆抗体反应的能力[6]。在诱导分化中，细胞周期通常是阻滞于G0/G1期[7，8]。本实验中流式细胞仪周期分析揭示葛根素和大豆甙元阻滞HL60细胞周期于G0/G1期，与NBT还原力实验相符。大豆甙元和葛根素诱导HL60细胞分化的能力高于葛根黄酮提取物，可能是葛根黄酮提取物中各种黄酮类化合物的相互影响而导致的。本实验说明葛根黄酮提取物通过诱导HL60细胞凋亡发挥抗肿瘤功效，而其单体黄酮—葛根素和大豆甙元是通过诱导HL60细胞分化而发挥作用，葛根素的抗肿瘤效果最差。三羟基异黄酮可能在葛根黄酮提取物诱导HL60细胞凋亡中发挥主效作用。后续研究需进一步揭示葛根黄酮提取物诱导HL60细胞凋亡的可能分子机制。
参考文献
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[3]罗音久，杜德极. 葛根提取物抗肿瘤作用的试验研究[J]. 四川畜牧兽医学院学报，2000， 14(4)：611.
[4]Aslamuzzaman K，Kenyon GD，David MS，et al. Inhibition of the proteasome activity， a novel mechanism associated with the tumor cell apoptosisinducing ability of genistein[J]. Biochemical Pharmacology，2003，66(6)：965976.
[5]Asterios ST，Ioannis SP， Ioannis SV. Mechanisms involved in the induced differentiation of leukemia cells[J]. Pharmacology & Therapeutics，2003，100(3)：257290.
细胞化学元素篇4
同位素用于追踪物质运行和变化过程时，叫示踪元素。用示踪元素标记的化合物，化学性质不变。人们可以根据这种化合物的放射性，对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学研究方法叫同位素示踪法。生物学上常用放射性同位素作为示踪元素，来研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。用于示踪的放射性元素一般是构成细胞化合物的重要元素，如3H、15N、18O、32P、35S等。在高中生物学教材中有多处涉及到放射性同位素的应用，下面对教材中的相关知识进行归纳例析。
一、光合作用和呼吸作用过程征元素的示踪
例1 一个密闭的透明玻璃容器内，放有绿色植物和小白鼠（小白鼠以植物为食），容器内供应18O2，每天给予充足的光照，一段时间后，绿色植物和小白鼠体内的有机物含18O的情况是（ ）
A.只在植物体内； B.植物和小白鼠体内均含有；
C.只在小白鼠体内； D. 植物和小白鼠体内均无
解析 18O在绿色植物体内的转移途径如下：
绿色植物体内的C6H1218O6被动物摄食，通过同化作用转变成自身的有机物。因此，植物和小白鼠体内的有机物都含有18O。答案 B
二、研究C4植物光合作用的途径
例2 在光照下，供给玉米离体叶片少量的14CO2，随着光合作用时间的延续，在光合作用固定CO2形成C3化合物与C4化合物中，14C含量变化示意图正确的是（ ）
解析 用14C标记CO2来追踪C4植物光合作用的途径：首先在C4植物叶肉细胞叶绿体内CO2与PEP相结合形成C4化合物，然后C4化合物进入维管束鞘细胞叶绿体并分解为CO2和丙酮酸，CO2与一个C5化合物相结合，形成2个C3化合物，C3 化合物被还原为C6H12O6。因此放射性同位素在C4植物光合作用过程中的转移途径为：14CO214C414C314C6H12O6所以C4 化合物先出现放射性C3化合物后出现放射性。由于含放射性标记的CO2是少量的，所以C4化合物的放射量达到一定量后，然后降低，逐渐转入C3化合物和C6H12O6中。答案 B
三、测定矿质元素在植物体内的分布和利用
例3 把菜豆幼苗放在含32P的完全培养液中培养1h，测其放射性，发现幼苗各部分都含有32P。然后将该幼苗转移到不含32P的完全培养液中培养1h，再测定放射性。预计32P在植株体内分布的变化最可能是（ ）
A.32P在下层叶中减少，幼嫩部分增加
B. 32P在下层叶中增加，幼嫩部分减少
C. 32P在下层叶中减少，幼嫩部分减少
D. 32P在下层叶中增加，幼嫩部分不变
答案 A
四、研究细胞的生物膜在功能上的联系
例4 把胰腺细胞培养在含3H标记的亮氨酸的培养液中，最后测得细胞分泌物中含有放射性的胰岛素。若用仪器追踪上述过程中放射性同位素在细胞结构中出现的先后顺序，最可能是（ ）
①线粒体 ②核糖体 ③中心体 ④内质网 ⑤高尔基体 ⑥细胞膜 ⑦细胞核
A.①②④⑦⑥ B.⑥②④⑤⑥
C. ②③⑦④⑤ D.⑥②⑦④⑤
解析 将用放射性同位素标记的氨基酸，使其进入胰腺细胞，目的是为了了解细胞的分泌蛋白的合成、加工、运输和分泌的过程。根据细胞的生物膜系统及细胞的亚显微结构的功能可知，其过程为：细胞膜核糖体内质网高尔基体细胞膜。答案 B
五、噬菌体侵染细菌实验
例5 用32P和35S标记噬菌体后，让其侵染细菌，繁殖一代后，在子代噬菌体的组成结构成分中，能够找到的放射性元素为（ ）
A.可在外壳中找到32P和35S B.可在DNA中找到32P
C.可在外壳中找到35S D.可在DNA找到32P和35S
解析 噬菌体是DNA病毒，32P只能标记在噬菌体的DNA上，35S只能标记在噬菌体的蛋白质外壳上。在噬菌体侵染细菌的过程中，只有DNA进入了细菌细胞，而蛋白质外壳没有进入，说明DNA具有连续性，是噬菌体的遗传物质，子代噬菌体的DNA和蛋白质外壳大都以细菌的成分为原料合成。所以在产生的子代噬菌体的结构成分中，只有子代噬菌体的DNA分子上带32P，完全没有35S。答案 B
六、DNA探针
例6 下列有关DNA探针的应用说法不正确的是（ ）
A.可应用于疾病的诊断 B.可应用于环境监测
C.可应用于基因治疗
细胞化学元素篇5
[关键词] 神经干细胞 研究
健康网讯: 崔桂萍 天津市脑系科中心医院 300060 1992 年， Reynolds [1] 首次成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（ neural stem cell, NSC ），于是“神经干细胞”这一概念被正式引入神经科学研究领域。可以总结为具有分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。不少文献中还提到神经祖细胞和神经前体细胞，目前认为，神经祖细胞是指比 NSC 更有明确发展方向的细胞，而神经前体细胞是指处于发育早期的增殖细胞，可指代 NSC 和神经祖细胞：与 NSC 相比，二者的分裂增殖能力较弱而分化能力较强，是有限增殖细胞，但三者均属 NSC 范畴。 1. NSC 的起源、存在部位及生物学特征 中枢神经系统的发育起源于神经沟、神经嵴、神经管；研究发现， NSC 在神经管壁增殖，新生细胞呈放射状纤维迁移至脑的特定位置；主要存在于室管膜区，在成脑生发区以外的区域也广泛分布，即具有高度可塑性的神经前体细胞。 现发现 NSC 的生物学特征为：（ 1 ）具有自我更新能力；（ 2 ）具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞；（ 3 ）处于高度未分化状态；（ 4 ）终生具有增殖分化能力，在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中（ 1 ）和（ 2 ）是 NSC 的两个基本特征。 2. NSC 的基础研究进展 NSC 的增殖和分化调控是目前 NSC 研究的核心问题，最近的研究资料显示， NSC 的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。 2.1 神经递质 神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递，还参与 NSC 的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨酸（ G1u ）、 5- 羟色胺（ 5-HT ）、 GABA 、甘氨酸（ G1y ）、乙酰胆碱（ Ach ）一氧化氮（ NO ）、肾上腺素与性激素等。 2.1.1 G1u ：在脑的发育过程中有高含量的 G1u 表达， Haydar 等 [2] 发现， G1u 可以通过大鼠胚胎皮质 AMPA/KAR 的激活调节室周区前体细胞的增殖，但 GLU 对室管膜区（ SZ ）和室管膜下区（ SVZ ）体内细胞的影响是不同的，它可增加 SZ 细胞的增殖，减少 SVZ 细胞的增殖； GLU 还可促进神经元生长和分化。 2.1.2 5-HT ：许多研究表明 [3] ， 5-HT 在皮质发育、突触形成中起重要作用，抑制 5-HT 合成或选择性损伤 5-HT 神经元则引起齿状回及脑室下区神经元增殖活性下降， 5-HT 可促进胶质细胞分化和髓鞘形成。 2.1.3 GABA ： GABA 是成体脑发育过程中主要的抑制性神经递质。 Haydar 等 [2] 发现， GABA 受体的激活可控制神经前体细胞的细胞周期； Stewart 等 [4] 研究发现， GABA 和 G1u 对脑内不同区域细胞增殖的影响是不同的，内源性 GABA 激活 GABA 受体在新皮质和调节神经前体细胞增殖方面起重要作用。 2.1.4 G1y 及其它： G1y 受体（ G1yR ）通过增加突触后细胞膜 C1 - 通透性而起突触后抑制作用。 Flint 等 [5] 发现， G1yR 在胚胎大鼠和初生早期脊髓中为未成熟迁移和分化的神经元中起重要作用，推测 G1yR 信号可能在突触形成中其重要作用； Ach 可通过 α -7 样烟碱乙酰胆碱受体激活导致新生大鼠嗅球原代培养细胞神经突起过度生长，相反， Ach 可抑制胚胎小鼠脊髓神经元的神经突起生长。有资料显示， NO 作为 CNS 的神经递质广泛参与神经细胞的存活、分化和可塑性的发生。而肾上腺素和性激素则可使新生小鼠齿状回新生细胞数量减少。 2.2 细胞外基质 细胞外基质（ ECM ）是组成间质和上皮血管中基质的不溶性结构成分，主要有胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。研究表明， ECM 可影响细胞分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程。 NSC 具有位置特异性的分化潜能，其增殖、分化和迁移与 ECM 有非常密切的关系。 2.2.1 B- 链蛋白：新近资料表明， NSC 与 ECM 的黏附功能可以调节细胞的生长和增殖。 NSC 中的 B- 链蛋白和 Tcy/Lef 转录因子家族参与了细胞的成活、增殖和分化。 Chenn 等 [6] 发现，在 NSC 中稳定表达 B- 链蛋白的转基因小鼠，其发育的大脑皮质表面积增大，沟回变深而宽，类似高级哺乳动物的皮质；侧脑室腔变大，与之相邻的脑室壁有大量增生的细胞；并且其大部分 NSC 在有丝分裂后可重新进入细胞周期，说明过度表达 B- 链蛋白并不破坏神经细胞正常发育分化，皮质的扩大是由于 NSC 增殖所致，提示 B- 链蛋白与 NSC 增殖有关。 2.2.2 Ree1in ： Ree1in 是 ECM 中分子质量为 400 × 10 3 的蛋白质，与神经细胞表面的整合素受体 α 3 亚基、极低密度脂蛋白和载脂蛋白 E 相结合，触发 Dab-1 胞液蛋白的衔接功能。在皮质发育过程中的神经元以及脊髓节前神经元迁移中起重要作用。 2.2.3 细胞黏附因子：细胞黏附因子是一种影响干细胞行为的重要信号蛋白，包括整合素和黏合素等。研究表明， ECM 中的整合素在调控 NSC 增殖、分化和迁移方面有重要的作用。脑内整合素与配体的相互作用促进了神经细胞的迁移，神经突起过度生长和少突胶质细胞髓磷脂膜的形成，在可塑性过程的成体突触结构形成中也起重要作用。黏合素家族中的 TN-C 在早期发育的中枢神经系统中广泛表达，但在分化过程表达下降；成脑受伤后， TN-C 表达上调，提示 TN-C 在提高中枢神经系统功能和可塑性方面有重要作用。 Garcion 等 [7] 用基因敲除 TN-C 的方法，发现小鼠少突胶质前体细胞向视神经方向迁移增加，但在各脑区的增殖率下降。 2.2.4 细胞生长因子： NSC 的增殖和分化还受多种细胞生长因子的调控，如成纤维的细胞生长因子（ FGF ）和表皮生长因子（ EGF ）等。 FGF 有三种受体， FGFR1 、 FGFR2 和 FGFR3 ，发育早期 FGF 在胎脑内进行增殖或神经发生的区域内表达，成年脑内在相应的神经发生区内也有 FGF 的持续表达，提示 FGF 在调节 NSC 增殖中发挥重要作用， EGF 在发育脑和成年脑内均有表达，神经元和星形胶质细胞均可表达 EGF 。 2.2.5 糖蛋白：糖蛋白家族包括层黏蛋白（ LM ），纤维连接蛋白（ FN ）和腱蛋白（ TN ）， LM 为基底膜的构成成分，可促进细胞黏附，调节细胞形态、分化及细胞迁移等； FN 具有形成 ECM ，促进细胞黏附、伸展、迁移、吞噬及血液凝固等多种生物学作用； TN 有促进细胞黏附，促进或抑制细胞增殖和迁移等多种作用，并有拮抗 FN 的细胞黏附作用。 Takano 等 [8] 新近发现， FN 对小鼠神经脊细胞中黑色素细胞的增殖、分化和迁移有重要作用。而 Chipperfield 等 [9] 则发现， ECM 中硫酸乙酰肝素葡糖胺聚糖（ HS ）可促进 FGF-1 对成体 NSC 的有丝分裂作用。 2.3 基因调控 2.3.1 Notch 基因： Notch 信号通路对于决定胚胎发生、造血和 NSC 分化起着至关重要的作用，当 Notch 被激活，干细胞进行增殖，当 Notch 活性被抑制，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。 Tanigaki [10] 等发现， Notch 在成体 NSC 发育为胶质细胞中起着重要作用，表达 Notch IC 明显增加星形细胞分化，减少神经元和少突胶质细胞的产生。 2.3.2 bHLH 基因： bHLH 基因具有高度同源性，是发育过程中转录网络的重要组成部分，广泛参与神经和肌肉、细胞增殖分化、细胞谱系决定和性别决定等生理过程。 bHLH 基因在神经上皮细胞发育为神经元中起关键并激活下游作用，可促进细胞脱离细胞周期，使细胞游离出皮质，并激活下游特定神经元分化的遗传基因表达。 2.3.3 同源盒基因：同源合基因在生物进化中有高度保守性，对下游靶细胞具有调节作用。同源盒基因目前有 Hox 、 Pax 和 Lim 等几大类；目前认为， Hox 的表达与中枢神经在发育中的分区有关，为不同神经元的发育提供位置特征； Pax 的早期表达与神经发育过程中空间和时间的局限性有密切关系； Lim 绝大多数在特定的神经元亚群中表达，参与特定神经元的发育。 Galli 等 [11] 发现，成体哺乳动物室周区的 NSC 表达同源盒基因 Emx2 分化成神经元和胶质细胞时 Emx2 基因表达明显下调；然而， Emx2 表达停止后， NSC 对称分化为两个干细胞的频率增加，随着 Emx2 表达的增加，这种对称分化能力逐渐降低。 2.3.4 Nestin 基因： Nestin 属于中间丝蛋白家族，存在于分裂的 NSC 中，成熟神经元和胶质细胞不表达，被选作 NSC 的识别物，通过检测 Nestin 的表达即可确定多潜能干细胞的存在。 3. NSC 的应用研究进展 随着对 NSC 了解的不断深入，国内外科学家积极开展对 NSC 的临床应用研究。表现如下： 3.1 细胞移植 试验研究表明， NSC 可用于损伤的神经细胞替代；如脑缺血的细胞移植治疗以成为目前脑移植的新热点。多项研究证实，移植胚胎脑组织是修复脑损害，重建神经功能的有效治疗途径。目前有自体移植和异体移植两种途径，由于胎脑来源有限，并受到孕龄选择、活力保持、异体排斥反应及伦理道德等因素制约，使异体移植受到很大限制。于是自体移植的体外分离培养受到诸多科学家的深入研究并取得成功。刘辉等 [12] 将人类胎儿海马 NSC 移植入大鼠颅脑损伤模型，一周后发现 NSC 移植治疗组与未治疗损伤组相比，呈明显运动功能改善， NSC 分裂增殖为神经元或胶质细胞，并向受损脑组织迁移，所以， NSC 是细胞移植治疗颅脑损伤的一种良好来源。 3.2 基因载体治疗 一些大分子物质如神经生长因子（ NGF ）、脑源性生长因子，尽管有治疗作用，却不能通过血脑屏障，其治疗作用受到限制；然而，用 NSC 作载体，将编码特定神经递质或蛋白质因子的基因转导入 NSC 载体，以治疗 CNS 疾病，取得可喜进展，在脑肿瘤基因治疗更为突出。 Benedetti 等 [13] 将表达白介素 -4 的基因转导到 C57BL6J 小鼠原代神经组织细胞，然后将这些细胞注入已建立的胶质母细胞瘤模型中，结果导致大多数带瘤小鼠的存活，磁共振证实了大肿瘤渐进性缩小、消失。 3.3 神经损伤的再生 大量的试验研究表明，脑缺血可以出现发生区内源性 NSC 激活，以达到神经再生。 Iwai 等 [14] 认为，脑缺血后的神经再生可分为增殖、迁移、分化三个阶段；他们通过沙土鼠海马齿状回缺血再灌注损伤试验模型发现，沙土鼠脑缺血后第 10 天 NSC 增殖达高峰；缺血后 20 天，开始增殖的细胞表达神经黏附分子，并从颗粒层下区迁移至颗粒层；在到缺血后 60 天，这些迁移的细胞才分化为成熟细胞。 3.4 生命科学的研究 首先，通过干细胞的研究来检测人体的一些数量和浓度极为稀少的蛋白质；其次，通过研究药物对胚胎神经干细胞的生长分化的影响，推测某些药物潜在的胎儿致畸作用，人胚胎干细胞还可以提供在细胞和分子水平上研究人体发育过程中极早期事件的方法，并且不会引起相关的伦理问题。目前采用移植 NSC 治疗帕金森病、亨廷顿病、脊髓损伤、缺血性中风及老年痴呆等疾病取得一定进展，仍有待于进一步的研究和探讨。 4. 结语 近几年，对 NSC 的基础研究和应用研究均取得了可喜的进展，随着认识的不断深入，尚有许多问题未能明确，如：人体能获得利用移植 NSC 的程度有多大？移植物增殖分化的关键基因是什么？国内外的部分研究已发现神经干细胞移植到动物脑内后有潜在的致瘤性，等等。这些都有待于深入研究和解决，也希望我们的研究能广泛应用于临床。 作者简介：崔桂萍，女，主管检验师。 参考文献 1. Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cell of the adult mammalian central nervous system. Science, 1992,225:1707-1710. 2. Haydar TF, Wang F, Schwartz MI, et al. Differential modulation of proliferation in the neocortical ventricular and subventricular zones. J Neurosci, 2000,20:5764-5774. 3. Roerig B, Feller MB. Neurotransmitters and gap junctions in developing neural circuits. Brain Res Brain Res Rev. 2000,32:86-114. 4. Stewart RR, Hoge GJ, Zigova T, et al. Neural progenitor cells of the neonatal rat anterior subventricular zone express functional GABA(A) receptors. J Neurobil, 2002,10:305-322. 5. Flint AC, Liu X, Kriegsein AR. Nonsynaptic glycine receptor activation during early neocortical development. Neuron, 1998,20:43-53. 6. Chenn A, Walsh CA. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science, 2002,99:4020-4025. 7. Garcion E, Faissner A, ffrench Constant C. 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细胞化学元素篇6
(一)要求学生比较系统地掌握关于细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等方面的基础知识，以及这些知识在农业、医药、工业、国防上的应用。
(二)通过生物学基础知识的学习，使学生受到辩证唯物主义和爱国主义思想的教育。
(三)要求学生掌握使用高倍显微镜，做简单的生理实验等的基本技能。
(四)培养学生自学生物学知识的能力，观察动植物的生活习性、形态结构、生殖发育的能力，分析和解释一些生物现象的初步能力。
二、确定教学内容的原则
(一)从学生今后进一步学习和参加社会主义现代化建设的需要出发，认真选取生物学基础知识：选取生物的结构和生理的知识。结构知识是理解生理知识的基础。生理知识是阐明生物的新陈代谢，生长、发育和生殖等的基础知识。因此，必须重视选取形态结构和生理的知识。
(二)选取生物学基础知识，必须做到理论密切联系实际。
1.选取生物学基础知识，要密切联系工农业生产实际。生物学是农业、畜牧业和医学等方面实践的理论基础，通过学习生物学知识，要使学生知道生物与生产的关系十分密切，应该利用和改造有益的生物，防除有害的生物。
2.要密切联系各地的自然实际。由于我国幅员广大，各地的生物种类有很大差别。因此，所选取的植物和动物，既要重视其典型性，又必须尽可能是各地比较常见的，以便学生可以直接观察到这些动植物和了解这些动植物的生活规律。
3.选取的生物学基础知识，要密切联系学生的日常生活实际，使学生加深对生物学知识的理解，同时更加深刻地认识学习生物学的意义。
(三)适当选取反映现代生物科学水平的生物学基础知识。
现代生物科学发展很快，生物课必须重视用现代生物科学的观点来阐述教学内容，并且适当地增加反映现代生物科学水平的知识内容，使学生对生物科学发展的现状有个初步的认识，为他们进一步学习现代生物科学知识和参加工农业生产打下必要的基础。
三、班级现状分析
本学期我任教高二（2）、（3）、（4）三个班级，三个班级人数分别为：46、45、46人，虽然通过班主任，我对个班的现状有了一点了解，但由于生物是从高二开始的起始课程，所以具体情况还不能下定论。
四、教学进度安排
高中阶段学习的生物学知识，是在初中生物教学内容的基础上进行的，学习生物的基本特征，侧重于生命活动的共同规律的内容。主要包括细胞、新陈代谢及其调节、生殖和发育、遗传和变异的知识。初中和高中两个阶段所学的生物学基础知识，既有所分工、又互相衔接，高中生物学是初中生物学知识的综合、概括和提高。
高中二年级开设的生物必修课（第一学期），每周2课时，共计34课时。讲述细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等生物学基础知识。
五、教学内容及其课时安排
高中生物必修课教学进度
单元
知 识
学生实验
课时
要 点
教学要求
项 目
绪论
生物的基本特征
生物科学的新进展
高中生物课学习的要求和方法
b
a
a
2
生命的物质基础
组成生物体的化学元素
组成生物体的化合物
b
c
实验：显微镜的结构和使用；生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。
2+1+1
生命的基本单位-细胞
细胞主要的亚显微结构和功能
细胞周期
细胞分裂
b
c
a
实验：
1．颤藻和水绵细胞的比较观察
2．植物细胞的有丝分裂。
生物的新陈代谢
光合作用的发现，光合作用及其重要意义
根对水分的吸收和利用
植物的矿质营养
动物的营养
呼吸作用
a
b
b
b
b
实验：
1．叶绿体色素的提取和分离
2．植物细胞的质壁分离与复原。
2+5
应激性和生命活动的调节
植物生命活动的调节
高等动物的激素调节
高等动物的神经调节
a
a
b
1+1+2
生殖和发育
减数分裂和配子的形成
a
2
具体教学内容如下：
绪 论
生物的基本特征(细胞结构，新陈代谢，生长现象，应激性，生殖和发育，遗传和变异，生物与环境的相互影响)的概述。
生物学的研究对象和发展方向。学习生物学的重要意义。
说明：生物学的研究对象和发展方向，只要求学生作一般了解。
一、细胞
细胞的发现。细胞学说。原生质的概念。
细胞的化学成分：水，无机盐，糖类， 脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
细胞的结构和功能：原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。一个细胞是一个有机的统一整体。细胞的分裂：无丝分裂。有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，初步学会使用高倍显微镜。
说明：在《细胞》中，以下内容只要求学生作一般了解。
1.细胞的发现，细胞学说，原生质的概念。
2.内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
3.无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式有有丝分裂。
二、生物的新陈代谢
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
绿色植物的新陈代谢：水分代谢——细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水；细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。渗透吸水的原理。渗透作用的概念。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。
矿质代谢——植物需要的元素(大量元素和微量元素)。根吸收矿质元素的过程——交换吸附。植物对离子的选择吸收。矿质元素的利用。
光合作用——光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应，暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用——呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
动物的新陈代谢：体内细胞的物质交换——单细胞动物与外界环境直接进行物质交换；多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
物质代谢——食物的消化(单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。哺乳动物的消化过程概述)。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
能量代谢——气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
新陈代谢的基本类型：同化作用的两种不同类型(自养型、异养型的概念和特点)。异化作用的两种不同类型(需氧型、厌氧型的概念和特点)。
〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
说明：1.在《生物的新陈代谢》中，以下内容只要求学生作一般了解。
(1)细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。*渗透作用的概念。
(2)根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
*(3)植物对离子的选择吸收。
(4)呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
(5)单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
(6)单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
三、生命活动的调节(4∶0)
植物生命活动的调节：生长素的发现。植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。
动物生命活动的调节：高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。昆虫的激素调节(内激素、外激素的分泌部位和生理作用，昆虫激素在生产上的应用)。神经调节(神经系统的调节功能)。≤第一范文 网整理该文章，版权归原作者、原出处所有≥
说明：在《生命活动的调节》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生长素的发现。
*2.昆虫的激素调节。
四、生物的生殖和发育(9∶0)
生物的生殖。生殖的概念。
生殖的种类：无性生殖(分裂生殖，孢子生殖，出芽生殖，营养生殖)；有性生殖(配子生殖中的卵式生殖)。这些生殖方式的特点和概念。
减数分裂与有性生殖细胞的成熟：减数分裂的概念和意义。的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。
生物的发育。发育的概念。
植物的个体发育(以荠菜为例)：胚的发育过程，胚乳的发育过程。
动物的个体发育(以蛙为例)：胚的发育过程(包括卵裂、囊胚、原肠胚各期)，各种组织、器官和系统的形成。胚后发育。胚的发育与环境的关系。
说明：在《生物的生殖和发育》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生殖的种类。
*2.无性生殖和有性生殖方式的特点和概念。
*3.植物的个体发育(以荠菜为例)。
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
（一）生命的基础
细胞的化学成分——水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。
有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。
2.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
3.〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，学会使用高倍显微镜。
(二)生物的新陈代谢(5∶2)
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。植物需要的元素(大量元素和微量元素)。矿质元素的利用。
光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应、暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。
多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
哺乳动物的消化过程概述。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
3.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。
根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
4.〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
(三)生命活动的调节(2∶0)
在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
细胞化学元素篇7
【关键词】 成体干细胞；非造血成体干细胞；胎血；骨髓；细胞生物学；神经元样细胞
Differentiating Ability of Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Rat Fetal Blood and Bone Marrow In Vitro
Abstract
To compare the growth characteristics of non-hematopoietic adult stem cells (NASC) derived from rat fetal blood and rat bone marrow in vitro， and to study the differentiation of these stem cells into neuron-like cells in vitro，the fetal blood of pregnant rats and bone marrow of adult rats were sterilely collected; mononuclear cells (MNC) were isolated by using standard Ficoll-hypague techniques and then cultured in DMEM/LG containing 10% fetal bovine serum (FBS). The acquired NASCs were subcultured for passage. The immunophenotype of NASCs was detected by flow cytometry. The expanded NASCs were induced to differentiate into neurons-like cells by β-mercaptoethanol (β-ME)， dimethylsulfoxide (DMSO)，butylated hydroxyanisole (BHA). The specific markers of these neuron-like cells were detected by immunocytochemistry. The results showed that two kinds of subcultured NASCs showed homogeneous spindle-shaped and expressed antigens CD44 and CD54，but did not expressed CD11b and CD45. The both induced cells were similar to neuron in morphology and were positive for nestin and neuron-specific enolase (NSE)，but negative for glial fibrillary acidic protein (GFAP). It is concluded that no significant difference of NASCs derived from pregenant rate fetal blood and adult rat bone marrow found in cell morphology and biological characteristics. NASCs of both origins can be induced to differentiate into neuron-like cells，so fetal blood can be regarded as another resource of NASC.
Key words adult stem cell；non-hematopoietic stem cell； fetal blood; bone marrow; cell biology; neuron like cell
非造血成体干细胞（non-hematopoietic stem cell，NASC）是骨髓中除造血干细胞外的来自各胚层的成体干细胞，包括具有CD34-及贴壁生长特点的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、心肌干细胞、神经干细胞等。在适宜的信号刺激下NASC能够被诱导分化成不同的骨髓微环境组成成分，如成骨细胞、 脂肪细胞和基质细胞，也能分化为神经细胞［1］、 肝细胞等。最近有学者已证实了人脐血也能分离培养出NASC，后者可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及肝细胞等分化［2］。相对于骨髓NASC来讲，脐血的来源丰富，收集方法简便易行，微生物和肿瘤细胞污染的可能性比较小，避免了自体髂骨穿刺获取骨髓的局限性。因此，脐血NASC作为一种新来源，用于细胞工程研究具有广阔的前景。我们分离培养大鼠胎血和骨髓NASC，观察比较两者生长特性及向神经元样细胞的分化能力有何异同。
材料和方法
动物与试剂
20只孕20天的Wistar大鼠、15只健康成年Wistar大鼠（雌雄不限）均购于山东大学实验动物中心，DMED/LG培养液、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司，β-甘油磷酸、异丙基甲基黄嘌呤、β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）购于Sigma公司，FITC标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、 CD54、 CD45单克隆抗体及小鼠IgG1单克隆抗体购于SEROTEC公司，兔抗大鼠GFAP、nestin、NSE抗体及免疫组织化学试剂盒购于Boster公司。
胎血NASC分离培养
无菌条件下，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg使孕鼠麻醉后，剖腹取胎鼠，剪断其颈部吸取断面血液，剪开胸腔抽取其心脏中血液至含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液中。密度梯度离心法收获MNC，PBS洗涤2次，按1×108 cells/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，培养液为含10% FBS、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的DMEM/LG，将培养瓶置于37℃、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养。1周后首次换液，每周换液2次。当细胞融合达70%-80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。
骨髓NASC分离
过量麻醉处死大鼠，无菌条件下取出股骨、胫骨，用含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液反复冲洗骨髓腔，获得骨髓冲洗液后离心、种植培养方法同上述胎血。
NASC的免疫表型检测
分别取扩增3、6代的胎血和骨髓NASC，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，再用含10% FBS的PBS洗涤，制成浓度为1×106 cells/ml的单细胞悬液。分别加入 10 μl FITC 标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、CD54、CD45单抗，阴性对照加入小鼠IgG1-FITC，避光室温孵育30分钟，PBS洗涤，流式细胞仪检测。
NASC诱导分化成成骨细胞
选第5代胎血和骨髓NASC，培养体系为含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和0.2 mmol/L抗坏血酸（美国Sigma公司）的DMEM。每周换液2次。在2周左右两者均可以形成成骨细胞，用茜素红染色，可见细胞浆中有大量的钙沉积。碱性磷酸酶染色呈阳性。
NASC诱导分化成脂肪细胞
选第五代胎血和骨髓NASC，诱导分化剂由1 μmol/L氢化考的松、0.5 mmol/L异丙基甲基黄嘌呤、0.1 mmol/L消炎痛和10％兔血清组成，培养液仍为DMEM，3-4天换液1次，在20天左右两者均可以形成脂肪细胞，进行油红染色，可见细胞浆内充满了油滴空泡。
诱导NASC向神经元样细胞分化及鉴定
定向诱导
分别取第5代胎血和骨髓NASC，以5×103 cells/cm2浓度接种于铺有载玻片的6孔板中制备细胞爬片。将细胞爬片随机分为实验组和对照组。实验组采取两步诱导法：先用含10% FBS、5 mmol/L β-ME的 DMEM/LG诱导1天后换为含10% FBS，2% DMSO，2 μmol/L BHA的DMEM/LG诱导1天。对照组仅用含10% FBS的DMEM/LG培养，不添加任何诱导剂。倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。
转贴于
免疫细胞化学鉴定
细胞爬片经PBS洗涤后用冷丙酮固定，在H2O2与甲醇1∶50混合溶液中室温封闭去除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液孵育，再滴加兔抗大鼠nestin、NSE、GFAP抗体，4℃过夜，生物素化山羊抗兔IgG 37℃孵育20分钟，再与链酶亲和素-过氧化物酶（SABC）反应20分钟，DAB显色，苏木素复染。阴性对照用PBS代替抗体，实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。
结果
NASC的生长特性
镜下观察，胎血贴壁细胞生长较快，原代培养7天时大部分呈纤维样束状排列，有少量圆形细胞成团或单个散在（图1）。大约10天时细胞达70%-80%融合首次传代。从第3代之后，视野中为形态均一的梭形细胞。这些细胞增殖一代约需4-8天，8代以内保持较快增长速度。骨髓细胞成分复杂，原代培养7天时贴壁细胞形态不均一，呈三角形、锥形或蝌蚪状，也有部分圆形细胞存在。约2周细胞首次传代，第3代以后呈均一的成纤维状，增殖速度与胎血MASC相似。
NASC免疫表型
流式细胞仪检测显示第3、6代NASC均表达CD44、 CD54，不表达CD11b、CD45。
NASC向神经元样细胞分化的形态变化及鉴定
β-ME诱导胎血NASC 7小时后原来的部分长梭形细胞开始缩短，胞体呈类圆形，且周围有多个不规则突起。换为DMSO、BHA后，胞体进一步收缩，约50%-60%细胞变为双极、多极和锥形，出现类似神经元的形态，有些细胞突起细长类似神经元的树突。β-ME诱导骨髓NASC 12小时后细胞形态明显改变，胞体收缩变圆，立体感增强，有突起长出，随后突起逐渐增多；换为DMSO、BHA后，细胞间突起相互连接，其胞体收缩成锥形、三角形或不规则形，折光性强，细胞伸出较多的细长突起，有的还有1-2级分支。对照组细胞形态无变化（图2）。
免疫细胞化学鉴定结果显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达Nestin，而NSE、GFAP不表达。DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性表达，阳性细胞胞浆呈棕黄色，GFAP始终阴性。未诱导细胞均不表达Nestin、NSE、GFAP。分别计算两种NASC分化后Nestin、NSE阳性率（显微镜下记数300个细胞中Nestin、NSE阳性细胞数而所得的百分比），经统计学分析差异无显著性。
讨论
随着NASC研究的深入，已有不少来源于成人骨髓外NASC的报道，如脐血、外周血、胎儿骨髓、脂肪和肌肉的NASC等。Goodwin等［3］报道，从脐血分离的CD34-及贴壁生长的细胞具多系分化能力，可分别表达成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞的标志。
本研究结果表明，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC生长特性相似，随着传代次数增加细胞逐渐纯化，呈形态一致的梭形，且增殖能力相同。只是在原代培养的初期，两种贴壁细胞形态和成分略有不同，骨髓细胞更为复杂。两种NASC的表面抗原表型一致，CD54、CD44阳性，但不表达各细胞系标记如CD34、CD11b和CD45。CD54是细胞间黏附分子，CD44是归巢相关黏附因子，CD11b为NK细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞的表面抗原，CD45为所有白细胞共同抗原。这说明胎血NASC与骨髓的一样，是源于非造血细胞的一类抗原稳定未分化的干细胞。
研究还发现，在相同的诱导条件下，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC向神经元分化过程中形态变化不完全一致，但共同特点是细胞胞体缩短变圆有细长的多个突起，具有典型神经元的形态。我们认为，形态学不一致可能与诱导前细胞自身状态及来源不同有关，以至分化后形态变化不尽相同，这不足以说明两者分化能力和特性不同。应该以分化细胞是否表达神经元标志物来判断。免疫细胞化学染色显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达nestin，而DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性，GFAP始终为阴性。统计学分析妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC分化后nestin、NSE阳性率无显著性差异，说明两者向神经元样细胞分化的能力相同。nestin是一种神经元中间丝蛋白，为神经干细胞特异标志物，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，其表达逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止。当神经元发育成熟时表达NSE，它是γ-γ糖酵解酶的同工酶，存在于神经元胞浆中。GFAP属细胞骨骼蛋白，是星形胶质细胞标志物。上述研究提示，NASC经诱导后首先分化为神经干细胞，然后向成熟的神经元分化，但不分化为星形胶质细胞。诱导剂β-ME、BHA有强抗氧化作用，已知在β-ME的作用下，细胞形态由梭形收缩成圆形、近圆形，这可能与其改变细胞氧化状态有关；β-ME能保护神经细胞的存活，促进轴突的显著增长，促进谷胱甘肽合成，清除氧自由基，但其具体作用机制尚待进一步研究。
NASC对不同的诱导因子反应不同，即使同种诱导剂，浓度及作用时间的差异也会引起NASC的反应各异，这导致了有些研究结果不甚一致。经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、DMSO、BHA诱导后，大部分NASC分化为神经元，而在bFGF、脑源神经营养因子(BDNF)的作用下，部分分化为神经胶质样细胞［4］。以全反式维甲酸、β-ME、cAMP 、bFGF、BDNF等作为诱导剂，经诱导的NASC中有69%细胞形态学上呈现神经胶质细胞的形态，有轴突样结构突起，且随诱导时间胶质细胞标志物的表达逐渐增多［2］。应用BDNF、NFκB受体活化子配体(RANKL)能诱导NASC同时向神经元和星形胶质细胞分化，且两者联合应用比单独应用时细胞分化率高［5］。因此，探讨诱导剂的最佳浓度、最佳组合及提高NASC分化率仍是需要研究者共同努力解决的重要问题。
本实验不仅说明了妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC都具有自我增殖的特性，而且被诱导分化为神经元样细胞的能力相同。作为干细胞的来源，人类脐血来源广泛、容易获得、免疫源性低等优点是骨髓无法相比的，这为今后人脐血NASC移植治疗神经系统疾病提供了动物实验依据。
参考文献
1 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res，2000；61: 364-370
2 Lee OK，Kuo TK，Chen WM，et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical blood. Blood，2004；103: 1669-1675
细胞化学元素篇8
文章编号：1672―1349(2007)06―0515 03
以往对神经保护的研究主要集中在神经元本身，认为只要阻断导致神经元坏死和凋亡机制中的一个或几个环节便可减轻神经元的进一步损伤。近年的研究发现，任何导致神经元损伤的原因如缺血缺氧、癫痫、感染、外伤、肿瘤、中毒、代谢障碍、退行性变或营养缺乏等都可能同时损伤胶质细胞和血管内皮细胞，后者的病理变化会加剧神经元的进一步损伤。因而提出神经血管单元(neurovascular unit)的概念，认为在神经保护治疗的同时必须兼顾对神经胶质细胞和血管内皮的保护。
天麻(Gastrodia elata B1，GE)为兰科天麻属多年生草本植物，具有熄风定惊、平肝潜阳、益智健脑、延缓衰老之功效。近年的研究显示天麻及其提取物天麻素(Gastrodin)、香草醇(Vanillylalcohol)、香草兰醛(Vanillin)、对羟基苯甲醛(Phydroxybenzol de―hyde)、对羟基苄醇(Phvdroxybenzylalcohol)等在神经损伤的多个环节起作用，同时涉及对胶质细胞和血管内皮细胞的影响。本文就此作一综述。
1 调节递质性氨基酸的浓度
1．1抗兴奋性毒性作用 脑内的兴奋性氨基酸(EEA)主要为谷氨酸(Glu)，它最主要的受体是N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体。正常情况下EEA作为神经递质对中枢神经系统的活动至关重要。当各种原因引起脑损伤时，从神经末梢释放增加而摄取减少，使其在细胞外间隙蓄积，受体过度激活，从而引起兴奋毒性(Excitotoxicity)，导致神经元过度兴奋、坏死和凋亡。
陈文东等在人神经母细胞瘤SH－SY5Y细胞系培养液中研究天麻素对由氯化钾诱导的神经细胞释放谷氨酸的影响，发现天麻素可以防止神经细胞产生或释放过多的Glu，提示天麻素有可能被用于治疗某些脑内Glu浓度升高或钙离子超载导致的中枢神经系统疾病。薛柳华等进行了天麻素对Glu致培养皮层神经细胞损伤的保护作用的研究，发现天麻素可拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性。
李运曼等发现天麻素能明显提高Glu诱导的PCI2细胞还原MTT的能力，抑制细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放；还可抑制兴奋性氨基酸引起的细胞内Ca2+含量的升高；剂量相关性的降低PCL2细胞凋亡百分率；同时可减轻H2O22引起的PCL2细胞损伤，降低静息状态下PC12细胞内过氧化氢的含量。
曹春雨等报道各种剂量的天麻都能使N－甲基D－天冬氨酸受体结合数下降，中剂量和大剂量天麻均能明显降低反复脑缺血再灌小鼠皮层NMDA受体结合数，提示天麻的脑保护机制与降低受体活性，抑制兴奋性氨基酸神经毒性作用有关。
天麻成分香荚兰醛和对羟基苯甲醛可显著的抑制Glu引起的人IMR 32成神经细胞瘤细胞内Ca2+的升高和细胞凋亡。应用小鼠双侧颈总动脉结扎再灌注模型造成兴奋毒性损伤，口服天麻促智颗粒(由天麻钩藤饮化载而成)可以调节模型小鼠脑组织内递质性氨基酸的含量，维持兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的动态平衡；还能够抑制缺血再灌注损伤引起的大脑皮质、海马两部位NMDA受体活性的增高，从而对抗兴奋毒性。以上研究说明，天麻可以从调节EEA的释放和摄取，抑制NMDA受体活性，防止Ca2+超载等方面对抗兴奋毒性。
1．2对脑内r-氨基丁酸(GABA)的影响 GABA作为脑内最重要的抑制性递质，能拮抗EEA过度表达所产生的兴奋毒性，保护神经元免于损伤。
An等[8]研究了天麻素对癫痫敏感性沙土鼠海马区GABA代谢的影响，发现天麻素在减少痫性发作评分的同时，升高海马区GABA的浓度。通过检测r-氨基丁酸转氨酶(GABAtransaminase，GABA―T)、琥珀酸半醛脱氢酶(succinic semialde―hyde dehydrogenase，SSADH)、琥珀酸半醛还原酶(succinic semi―aldehyde reductase，SSR)等指标观察天麻素对GABA降解影响，发现天麻素能显著减少GABA-T、SSADH和SSR的摄取。Ha等发现羟基苯醛(4－hydroxybenaldehyde)对GABA―T的抑制作用强于氨基烯酸(Vigabatrin)和丙戊酸(Valproic acid)。表明天麻提取物能够通过抑制GABA的降解，有效提高GABA的浓度，减少神经元的损伤。
2对一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的影响
铅中毒使脑内NOS活性减少，阻碍小脑长时程抑制(LTD)的形成和维持，进而损害学习记忆。天麻可以拮抗铅中毒引起的大鼠小脑匀浆NO水平的降低和学习记忆损害。胡建军等研究发现天麻素能减轻胶质细丝酸性蛋白(GFAP)纤维素样改变；减少LDH漏出量；抑制NOS活性，从而减轻NO过量产生所引起的细胞毒性作用。
缺血再灌注损伤则引起体外培养星形胶质细胞NOS表达的上调，天麻素和川芎天麻液可对抗这种上调，从而抑制NO本身及由其而产生的一系列氧自由基的毒性。可见，天麻通过对NO的双相调节发挥其益智和神经保护作用。
3抗氧化作用
超氧化物歧化酶(SOD)是组织内重要的抗氧化活性物质，是氧自由基的清除剂，能够有效地清除超氧阴离子自由基(O2－)，保护细胞免受损伤。丙二醛(MDA)是氧自由基攻击生物膜结构中的多不饱和脂肪酸后形成的脂质过氧化物，脑组织缺血缺氧后SOD含量下降，氧自由基增加，导致脂质过氧化过程加剧。研究表明，天麻增加脑内SOD含量，降低MDA含量，减少自由基产生，抑制脂质过氧化过程，提高脑细胞的存活率，在海马CA1区尤为显著。
对体外培养的缺血再灌注神经细胞，天麻素能明显地抑制其过氧化脂质(LPO)的增多。荚香兰醇则能够显著的抑制脑内注射氯化铁造成的大鼠癫痫模型皮层内LPO的升高。荚香兰醛和对羟基苄醇均可以抑制大鼠脑匀浆、微粒体、线粒体的脂质过氧化反应[16]。川芎天麻液可提高缺血再灌注损伤大鼠脑内SOD的含量。天智颗粒可在体内和体外显著抑制大鼠脑LPO的生成，使反复缺血再灌注小鼠皮层和海马谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px，GPX)活性增高，但对脑组织SOD的活性未见影响，提示天智颗粒抗氧化作用的机制主要是提高GPX的活性。
4对凋亡相关基因表达的影响
神经细胞凋亡是多种疾病脑损伤的共同过程。Bcl－2，HSP，C-fos等为抑制细胞凋亡基因，而Bax、p53、caspase－3等为促细胞凋亡基因。脑缺血再灌注损伤可引起体外培养海马神经元Bcl-2表达减少和bax表达增加，黄建梅等观察了抗呆I号(有天麻素等中药提取物组成)对体外模拟脑缺血再灌注损
伤原代培养海马神经元调控基因Bcl-2和Bax表达的影响。发现抗呆I号可通过上调神经元Bcl－2表达、下调Bax的表达对缺血再灌注损伤的神经细胞起到一定的保护作用。徐坚等通过实验研究证明，天麻可上调神经元Bcl－2的表达和下调Bax和p53基因的表达，从而起到对缺血再灌注脑组织神经元的保护作用。
胡俊峰等[19]观察醋酸铅染毒对大鼠海马和小脑C-fos基因表达及学习记忆功能的影响，同时观察阿胶、天麻的拮抗作用。发现亚慢性铅染毒造成大鼠学习记忆障碍的同时，导致C-los基因表达水平的下调，而天麻、阿胶可通过不同途径拮抗其对C―fos基因表达及学习记忆能力的影响。
5稳定细胞膜作用
在神经细胞损伤过程中，细胞膜状态是其损伤从可逆向不可逆转变的重要环节。膜流动性主要取决于磷脂，它可以敏感的反映细胞膜的状态。由于缺氧与兴奋性损伤，体外培养神经细胞缺血5h后即观察到膜流动性的下降，再灌后膜流动性继续下降。天麻素具有维持神经细胞膜流动性的作用，其机制可能是抑制磷脂酶的激活而阻止磷脂的降解。细胞膜受损达一定程度，膜的通透性增大，使生理情况下很少漏出的LDH大量漏出，细胞外LDH的浓度可以反映细胞膜损伤的程度。缺血再灌注以及谷氨酸的兴奋毒性使培养神经细胞膜和胶质细胞膜损伤，LDH大量漏出，表现为培养液中的LDH含量增高；天麻及其有效成分天麻素可以显著的减少上述损伤造成的LDH的漏出，并能显著地降低自由基的生成，表明天麻素有清除过多的自由基作用和细胞膜保护作用。天麻也可以通过保护脑细胞膜ATP酶的活性，改善离子转运，防止脑缺血缺氧后脑水肿的形成。
6对胶质细胞的影响
胶质细胞可分泌多种细胞因子和神经营养因子，在联系和维持神经元生存微环境中起着重要作用。生理情况下，胶质细胞数量的增多对活跃神经元起到更好的支持作用，对大脑的学习记忆功能有益。口服天麻可以明显使大鼠大脑胶质细胞增生，胶质细胞群面积增大，胶质细胞数量增多，这是天麻益智作用的机理之一。当多种原因引起脑损伤时，胶质细胞过度增生，增生的胶质细胞一方面产生和释放肿瘤坏死因子和NO等神经毒物质，促进损伤的发展；另一方面产生神经营养因子，有利于轴突的再生和修复。体外培养的星形胶质细胞在缺血再灌注损伤后胶原纤维酸性蛋白，星形胶质细胞的特异性标志物的阳性计数较正常组显著增高，且胶质细胞发生纤维样变，天麻素可以明显地抑制GFAP的增多，即通过抑制胶质细胞的过度增生以减弱其对神经细胞的进一步损伤，还能够减弱胶质细胞纤维样改变的程度。
7对血管的影响
天麻能抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增加，抑制5－羟色胺(5－HT)、PGF4所致大鼠皮肤毛细血管通透性增加，说明天麻对炎症早期的渗出有抑制作用，并能明显抑制多种炎症的肿胀。
孟云辉等观察天麻钩藤饮对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用。发现天麻钩藤饮含药血清可抑制AngⅡ导致的细胞损伤，减少TNF－α的分泌，升高PPAR-rmRNA的表达。提示天麻钩藤饮可对抗AngⅡ所致的HUVECs损伤，保护血管内皮细胞功能。
细胞化学元素篇9
近年的免疫组织化学研究表明，许多神经疾病尤其AD患者脑内有强烈的局灶性炎症反应，组织培养及分子生物学方法也证明脑细胞可产生许多炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β等)、补体蛋白及其他免疫分子。这些炎性蛋白质及小胶质细胞(microglia,Mi)活化同AD病变间的密切关系，使人们提出了神经元退化的炎症学说。近年来有关β-淀粉样蛋白(amyloidproteinβ，Aβ)激活免疫炎症过程而间接造成神经退行性病变的假说获得了不少新的证据。AD患者脑内的Aβ类不溶性大分子以及胞外的NFTs,极易被吞噬细胞发现，因而作为慢性刺激物质而逐渐积累，并刺激炎症反应不断加强，造成AD的慢性炎症状况。
AD的许多促发因素如遗传、年龄、环境因素等均可诱发初始病变(如AD的SP及NFT)，这些病变即使引起某些神经元死亡，也是较为轻微的，因而病变进展缓慢；然而这些初始病变可激发炎症反应，后者发展至一定程度则导致更多神经元死亡，造成更多的病变，进而激发更严重的炎症反应，如此形成一个不断加强的自身毒性环路(autotoxicloop)。这个正反馈环路导致了临床所观察到的AD及其类似疾病在起始阶段进展较缓，到某个时期病情才急剧恶化。由此可见，慢性炎症可能是AD发病机制的必要因素。AD是一种由Aβ沉积，通过激活周围Mi产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答，加速神经细胞死亡，而致记忆减退和认知障碍的疾病。而记忆与颞叶海马CA1区神经元活性有关，提示AD发病机制之一可能是Aβ等启动CA1区神经元细胞凋亡。
2神经元凋亡的诱导
细胞凋亡(PCD)是由细胞基因控制的一种主动死亡过程，特定基因由于种种原因编码自杀性蛋白而致DNA裂解。愈来愈多的证据表明，大多数动物细胞皆能自我致死，而且这种普遍性的自杀程序能由发自其他细胞的信号所激活或抑制。例如许多发育中的脊椎动物神经元的生存依赖于与其连接的靶细胞分泌的神经营养因子(NTF)，若NTF缺乏可致神经元发生PCD。细胞的PCD也受外源性因素的影响，但诱导PCD的内源性与外源性因素都必须通过特定基因而发挥作用。
2.1淀粉样蛋白与神经毒越来越多的证据表明，Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素［5］。分子克隆研究证明，Aβ来自一分子量更大的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,APP)。目前多数学者认为，Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件，超前于其他脑区损伤和临床症状数年［6］。在发生顺序上，Aβ的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状。最为直接的证据是Aβ在一定条件下能表现出神经毒性。90年代初，Yankner等首先观察到较高浓度的Aβ能引起神经元退化和死亡，并证实引起毒性的必需结构是其25～35位的氨基酸序列(Aβ25～35)。最近发现，Aβ的神经毒性包括两个方面［7］，一是增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应，一是直接的细胞毒性。实验发现，多数细胞与Aβ接触后就能表现出细胞肿胀、染色质浓缩、核内DNA断裂等细胞凋亡典型的形态和生化特征［8］，仅在少数细胞内或与兴奋毒素共存时才表现出神经元肿胀、膜溶解、乳酸脱氢酶释放等坏死(necrosis)的特征［9］。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制，主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+稳态［7］，降低K+通道的功能［10］，增强致炎细胞因子(cytokine)引起的炎症反应［11］。由于多种因素相互影响给研究带来了相当大的难度。
2.2炎性细胞因子和神经毒
2.2.1白细胞介素6(IL-6)：在中枢神经系统(CNS)，IL-6主要由Mi和星形胶质细胞(astrocyte,As)产生，其受体也广泛存在于丘脑、海马、皮层等脑区的神经元膜上。IL-6的神经元毒性作用主要在转基因小鼠脑内得到证实。Campbell［12］报道，IL-6转基因小鼠具有严重的神经疾病症状，表现为瘦小、行为异常、震颤、共济失调和癫痫。神经病理特征为，海马与小脑出现明显的神经元退化，尤其是海马CA1区域树突萎缩，树突空泡化和树突数目减少，并且伴随着高表达的IL-6mRNA和高水平的IL-6。这些结果表明，脑内IL-6水平的升高是导致转基因小鼠神经元退化的主要原因。此外IL-6转基因小鼠研究还发现，隔一海马胆碱能通路的功能受到严重损害［13］，由于隔一海马通路参与记忆印迹的形成，因此脑内高水平的IL-6有可能影响学习与记忆功能。
有关IL-6与Aβ或APP关系的研究已有报道［14］。在原代培养的大鼠皮层神经元实验中，IL-6200ng/mL与神经元接触6h之后，APPmRNA的表达增加了大约一倍。由于IL-6与APP或Aβ共存于AD的SP内，提示IL-6对APP的表达具有直接调控作用，可以促进APP产生，进而导致Aβ沉积，诱发AD。α2-M是已知最强的蛋白酶抑制剂，与IL-6共存于AD皮层与海马SP内。曾有报道［15］，在培养的人神经元细胞株内，α2-M可抑制APP的正常分泌，导致Aβ形成增加。在人SH-SY5Y神经元细胞培养实验中，α2-M的基础合成很低，但用IL-6刺激后其合成被强烈诱导，α2-M水平大约增加了20倍［16］。这些结果提示，IL-6与α2-M在AD脑内的共存具有功能性联系，IL-6可能通过诱导α2-M合成，进而抑制APP的正常酶解，导致Aβ生成与沉积异常增加，从而诱发AD病理发生。
2.2.2肿瘤坏死因子-α(TNF-α)：LPS可刺激Mi产生TNF-α，As也可能产生少量TNF-α。在人胚胎原代神经元培养中发现，TNF-α有增强N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经毒性作用［17］，且对人神经元细胞HN33.1有细胞毒作用。大鼠神经细胞培养中，TNF-α通过作用于As间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损伤。直接将TNF-α注射到小鼠小脑，可引起普遍性损伤。TNF-α可引起牛及啮齿类动物的Mi通过PCD机制发挥细胞毒作用。但这一作用在人类尚没有被发现。
2.2.3转化生长因子-β(TGF-β)：TGF-β是具有多功能作用的细胞因子，它可由多种细胞产生，在胚胎发生期的神经细胞发育过程及免疫炎症反应过程中，TGF-β都具有重要作用。大鼠新皮层神经细胞培养中，TGF-β可减少由细胞毒物、缺氧、缺血或谷氨酸引起的细胞损伤，而起到了神经保护作用［18］。使用人类胚胎皮层细胞培养，也发现了TGF-β可减轻由Aβ引起的神经细胞损伤。TGF-β对神经细胞的这些保护机制目前并不清楚。相反的结果也发现，TGF-β可能具有细胞损伤作用。由于其抑制了星形细胞谷氨酰胺合成酶的活性而增加了外源性谷氨酸造成的神经细胞损伤。也有报道TGF-β伴随Fos-Iacz的表达而参与细胞凋亡过程。
2.3一氧化氮(NO)与神经毒在人的中枢神经系统，As是产生NO的主要细胞，IL-1β是一个关键性因子，可直接刺激人As产生NO［19］。TNF-α及IFN-γ可加强IL-1β的作用。实验也证明这些白细胞介素处理过的As能产生足够量的NO，而造成神经细胞损伤［19］。Mi产生的NO具有细胞毒性作用，它可能参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。NO合酶抑制剂或能抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。此外，能释放NO的硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)能直接杀伤培养中的人类胚胎皮层神经元。炎症条件下，脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合酶(inducibleNOS,iNOS)，产生大量NO，导致神经元坏死或凋亡。一般情况下，持续与低水平的NO或过氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡，而短暂与高水平的NO或过氧亚硝酸盐接触则引起神经元坏死。
此外目前的研究结果也证实，前列腺素E2(PGE2)直接与海马神经元接触引起了神经元凋亡性死亡［20］。一些神经递质如多巴胺(DA)，谷氨酸盐(glutamate,Glu)等可使某些神经元细胞凋亡。Glu是Mi激活后产生的一类神经毒物质，它是一种兴奋性氨基酸(EAA)。目前认为，神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎性损伤等都可能与EAA的神经毒性有关。Yamada和Hatanaka报道［21］，在20d胎大鼠海马神经元培养中，Glu与神经元接触15min，可引起海马神经元显著退化。
3神经元凋亡的基因调控
PCD是受遗传基因调控的，在调控PCD的过程中常有新基因表达，合成新的蛋白。在调控的信号中有的是起正调节作用，也有的是起负调节作用。不同的细胞由不同的基因诱导PCD。这些基因有：ced-3/ced-4、nedd2、TRPM-2、Fas(Apo-1)、c-fos、c-jun、c-myc、野生型p53等。抑制PCD的基因有：ced-9、bcl-2、突变型p53等［22］。此外，IL-1β转化酶家族是一些新发现的细胞“死亡蛋白”，与ced3、nedd2具有高度同源性，在炎症因子诱导的神经元PCD中起重要作用。
IL-1β转化酶(IL-1beta-convertingenzyme,ICE)是存在于许多哺乳动物细胞内的一种蛋白酶，是近年来研究较多的“死亡蛋白”之一。人类ICE最初是在单核细胞中发现的一种半胱氨酸蛋白酶，可使非活性的前体IL-1β(相对分子质量为33000)在116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间酶解为具有活性的相对分子质量为17000的IL-1β细胞因子。ICE与线虫细胞死亡基因ced-3有高度同源性［23］。Kumar等先克隆出鼠nedd-2基因，长3.7kb,其基因编码的蛋白可促进鼠细胞的凋亡，LinWang以nedd-2为模板通过PCR扩增制备探针从人胎脑cDNA文库筛选出人nedd-2基因，其编码的氨基酸序列和ICE/ced-3顺序同源。转染小鼠ICE基因或ced-3基因，使其过度表达均可引起小鼠纤维母细胞出现凋亡。另外，在发生凋亡的细胞中可见成熟的IL-1β分泌增多。这一结果提示，ICE/ced-3基因可能是决定细胞死亡基因之一［24］。目前认为ICE在由Fas、TNF及一些炎症因子等诱导的细胞凋亡中起重要作用。ICE是Fas、TNF及炎症因子介导的主要通路，其研究的重要性可想而知。AD患者神经细胞退行性改变有ICE参与。由于细胞死亡基因ced-3与nedd-2和ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素均可激活该基因，ICE产生可在细胞内产生一种细胞死亡蛋白，而ced-3、nedd-2和ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素均可激活该基因，ICE产生的IL-1β对神经细胞起直接或间接毒性作用，导致神经元凋亡。证明ICE表达促进神经细胞凋亡，而对ICE表达的调节，寻找一些抑制ICE活性的药物，对一些凋亡过多的疾病如AD及Parkinson病有重要的治疗潜力。
4抗炎药物抑制神经元凋亡的可能性
20世纪的神经科学已获飞速发展，但造成神经元死亡的原因尚未明了，以致许多全球性致死性神经疾病一直缺乏有效的防治手段。AD发病的炎症学说启发人们用抗炎药物减缓或阻止AD发病。它不同于近10多年惯用的两种治疗方法，即基于胆碱学说的各种AchE抑制剂如他克林(tacrine)、新斯的明等和以吡烷酮醋胺为代表的促智药(nootropicdrugs)，被用来试图改善大脑皮层的代谢能力，进而减轻痴呆程度［25］。上述治疗方法并不能减缓皮层神经元的急剧损毁，因而无消除病变的根本原因。人们转而思索用抗炎疗法来抑制神经元死亡。这个设想已被临床试验所证实，有人在用非甾体类抗炎药物(NSAID)吲哚美辛(indomethacin,IM)治疗AD的一项有安慰剂对照的双盲试验中发现，接受100～150mg/kgIM治疗的患者，其认知功能的改善明显优于安慰剂对照组［26,27］，然而尚需要更大规模的临床试验及进一步研究，以筛选出选择性调节免疫炎症反应和抑制神经元死亡的新药。
参考文献
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24MiuraM,ZhuH,RotelloR,etal.InductionofapoptosisinfibroblastsbyIL-1β-convertingenzyme,amammalianhomologoftheC,eleganscelldeathgeneced-3.Cell,1993,75:653-660
细胞化学元素篇10
本章包括《组成生物体的化学元素》和《组成生物体的化合物》两节教材。第一节教材需用1课时教学，第二节教材需用2课时教学。此外，有1个学生实验。
第一节《组成生物体的化学元素》。首先，在节的引言中，明确指出自然界中的生物和非生物都是由化学元素组成的。接着，讲述组成生物体的化学元素、组成生物体化学元素的重要作用、生物界与非生物界的统一性和差异性三方面内容。
关于组成生物体的化学元素的内容，一开始就指出组成生物体的化学元素主要有20多种，紧接着以玉米和人体为例，将含量较多的化学元素以及这些元素的含量列成表。通过对表中内容的分析，概括出两点：一是组成玉米和人体的基本元素是C、O、H、N；二是组成生物体的各种化学元素，在不同的生物体内，含量相差很大，由此进一步提出了大量元素和微量元素的概念和种类。
关于组成生物体化学元素的重要作用的内容，首先强调指出，在大量元素中，C是最基本的元素，C、H、O、N、P、S这6种元素是组成细胞的主要元素。接着，说明组成生物体的化学元素进一步组成多种多样的化合物，这些化合物是生物体结构和生命活动的物质基础。
关于生物界与非生物界的统一性和差异性的内容，主要是从组成生物体和无机自然界的化学元素的相同和不同，提出了辩证唯物主义观点：一点是从组成生物体的化学元素在无机自然界中都可以找到的事实，来说明生物界和非生物界具有统一性；另一点是从组成生物体的化学元素在生物体内的含量与在无机自然界中的含量相比，两者相差很大的事实，来说明生物界和非生物界还具有差异性。
第二节《组成生物体的化合物》。首先，明确提出构成细胞的化合物，主要包括无机化合物的水和无机盐，有机化合物的糖类、脂质、蛋白质和核酸。然后，依次讲述构成细胞的这6种化合物。，全国公务员共同天地
关于无机化合物的水，着重说明它在细胞中含量最多；水在不同的生物体中和不同的组织、器官中含量不同；水在细胞中以结合水和自由水两种形式存在；水在细胞内的重要作用。最后强调指出，生物体的一切生命活动，绝对不能离开水。
关于无机盐，强调指出它在细胞中虽然含量很少，且大多数无机盐以离子状态存在于细胞中，但是具有多方面的重要作用：无机盐既是细胞内复杂化合物的重要组成成分，又对维持生物体的生命活动有重要作用。
关于糖类，主要说明它由C、H、O3种化学元素组成，它是构成生物体的重要成分，也是细胞的主要能源物质；糖类大致分为单糖、二糖和多糖等几类(其中的葡萄糖、核糖、脱氧核糖、淀粉、糖元等是重要种类)，以及它们在生物体内的分布和重要作用。
关于脂质，主要说明它由C、H、O3种元素组成，一般包括脂肪、类，全国公务员共同天地脂和固醇等；这几类物质在生物体内的分布和重要作用，并强调指出，磷脂是构成细胞膜和多种细胞器的膜结构的重要组成成分。
关于蛋白质，是本节的重点内容，教材中比较详细地讲述了有关内容。首先，强调蛋白质在细胞中只比水的含量少，大致占细胞干重的50%以上，它是细胞中各种结构的重要化学成分。接着，说明蛋白质主要由C、H、O、N4种化学元素组成；它是一种高分子化合物，相对分子质量很大；基本组成单位是氨基酸；蛋白质的分子结构是由许多氨基酸分子互相连接而成；蛋白质分子的多样性，决定了蛋白质在生物体内有多种重要的功能。
关于核酸，首先明确指出核酸是遗传信息的载体，它对生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成有极重要的作用。然后，说明核酸由C、H、O、N、P等化学元素组成，也是一种高分子化合物；核酸的基本组成单位是核苷酸；核酸可以分为脱氧核糖核酸和核糖核酸两大类。
本节教材的最后一段指出，任何一种化合物都不能单独地完成某一种生命活动，只有按照一定的方式有机地组织起来，才能表现出细胞和生物体的生命现象。这里也体现了辩证唯物主义的观点。
在本章中，为了配合学习有机化合物的内容，安排了学生实验《生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定》，主要是根据某些化学试剂，能够分别使生物组织中上述三种有机化合物，产生特定的颜色反应，来鉴定生物组织中有还原糖、脂肪和蛋白质的存在。
二本章与其他章的联系
1.本章是绪论后的开篇章，所讲内容是最基础的知识，因此与后面的各章都有密切关系，是学习好其他各章的基础，教学中要注意前后知识的联系。
2.组成生物体的化学元素和化合物的知识，是讲述第二章《生命活动的基本单位──细胞》的重要基础。例如，讲述细胞膜的结构和功能，会用到磷脂、蛋白质等知识。
3.第三章《生物的新陈代谢》，与本章联系十分紧密。例如，讲述植物的物质代谢时，要用到酶、水、大量元素、微量元素等知识；在讲到人和动物的物质代谢时，要用到糖类、脂质和蛋白质的知识。
4.第四章《生命活动的调节》在讲到激素的调节作用时，要用到蛋白质等知识。
细胞化学元素篇11
凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。凋亡信号途径包括外源性、内源性/应激途径。缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但脑缺血后神经元凋亡发生的确切机制目前还不十分清楚。内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，内质网在应激状态下，可迅速诱导凋亡。毒胡萝卜素(thapsigargin)为不可逆性内质网钙ATP酶抑制剂，可诱导内质网应激。本研究旨在探讨大鼠皮层神经元内质网应激诱导细胞凋亡机制以及参麦注射液的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
新生SD大鼠（出生24 h内）由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鄂）20040007。高糖DMEM、神经元基础培养液、B27、胎牛血清、马血清购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFTTC购自Bender MedSystems公司；Fura2/AM购自晶美生物公司；活性caspase3、caspase9试剂盒购自BioVision公司；AntiGRP78多克隆抗体购自Stressgen公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz公司；神经元特异性烯醇化酶(NSE)组化试剂盒购自北京中山公司；其他均为市售分析纯。参麦注射液由人参、麦冬组成，每支10 ml,含生药0.5 g，批号为0807046，正大青春宝药业有限公司出产。
1.2 仪器
CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus日本)；全自动酶标分析仪 （Thermo electron corporation Multiskan MK3,美国）；流式细胞仪(FACSCLSR，BectonDickton，美国)；F2000型双波长荧光分光光度计(Hitachi 850，日本)。
1.3 分组与给药
实验分为阴性对照组 (正常培养神经元)，毒胡萝卜素组(神经元基础培养液中加2%B27，加2 μmol/L毒胡萝卜素24～48 h)，参麦治疗组(神经元基础培养液中加2% B27，2 μmol/L毒胡萝卜素，参麦注射液10 ml/L 24～48 h)。
1.4 皮层神经元培养
取出生24 h以内SD大鼠皮层于冷解剖液(4℃)中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成≤1 mm3的组织块，入0.1%胰酶液，37℃水浴消化20 min，加种植培养液 (DEME中添加10%胎牛血清，10%马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天换维持培养液(神经元基础培养液中加2% B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。
1.5 神经元的鉴定
免疫组织化学染色标记NSE(北京中格公司产品)和IgG免疫荧光染色(FITC标记的兔抗鼠IgG 1∶2 000稀释)鉴定神经元。
1.6 参麦注射液对原代神经元活力的影响
神经元活力测定采用MTT法。取前述原代神经元(细胞计数达1×106/ml)，按每孔100 μl 接种于96孔板，培养5 d后随机分组，设置空白对照组 (用来调零，只加培养基，不加细胞)、阴性对照组 (药物浓度为零，加细胞，加培养基)、治疗组 (加参麦注射液，加细胞，加培养基)，治疗组参麦注射液终浓度10 ml/L。分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 μl，37℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO 100 μl，室温下放置10 min。待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR400 ELISA读数仪测定MTT吸光度值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。
1.7 流式细胞分析仪检测神经元凋亡及caspase3、9活性
取上述分组培养的神经元经胰蛋白酶消化后在4℃离心5 min，去上清后细胞沉淀用冷PBS洗2次，加195 μl结合缓冲液悬浮细胞，然后加入Annexin VFTTC 5 μl，室温避光孵育10 min，结合缓冲液洗3遍，190 μl结合缓冲液重悬细胞，加10 μl (20 μg/ml) PI (终浓度1 μg/ml)，上机检测，重复3次。取上述各组及阴性对照组细胞 (正常培养的细胞培养液中加1×106/ml caspase3、9抑制剂共孵育) 消化、重悬，取300 μl细胞悬液于EP管中，每管分别加入1 μl FITC标记的caspase3、9，37℃ 5% CO2恒温细胞培养箱孵育1 h，3 000 r/min离心5 min，弃上清，0.5 ml缓冲液重悬细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 μl缓冲液重悬细胞，上机检测，重复3次。
1.8 GRP78、Bcl2、细胞色素C免疫印迹分析
细胞化学元素篇12
目的 研究脑心清及其黄酮成分对海马神经元细胞l型ca2+通道活性的影响。 方法 采用全细胞记录式(wholecell model)的膜片钳技术记录海马神经细胞l型ca2+通道电流变化。 结果 槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%，可使ica,l 的i-v相关曲线下移，但没有电压依赖性特征，也不改变钙通道的电学特征。结论 脑心清及其黄酮成分对海马神经细胞l型ca2+通道活性有激活增强作用，有利于神经元细胞内钙稳定，发挥抗缺血再灌注损伤的作用。
【关键词】 l 型ca2+通道 脑心清 黄酮 槲皮素 海马神经元 膜片钳技术
abstract:objective to investigate the effects of quercetin,fldkp70 and naoxingqing (nxq) on ltype calcium channel (ltcc) in the cultured pyramidal neurons isolated from hippocampus.methods calcium currents were recorded in wholecell patchclamp mode with quercetin,fldkp70 and nxq in the measurement medium.results it was found that 5.0～25.0 μg/ml of quercetin,fldkp70 and nxq enhanced ltype calcium channel current by 61.6%,55.3%,52.0% ，respectively in the cultured neurons. significantly,the quercetin,fldkp70 and nxqmediated increases of calcium currents saturated at the concentrations around 100 μg/ml in the cultured neurons.conclusion these findings suggested that the ltype calcium channel in cultured pyramidal neurons could be modulated by quercetin,fldkp70 and nxq,which might be beneficial to the intracellular calcium homeostasis in the insulted and damaged susceptible neurons under ischemia/reperfusion disorder.
key words:ltype ca2+ channels; hipocamcal pyramidal neurons; naoxinqing (nxq);flavonoids;quercetin;patchclamp
在复杂的编码细胞内激活细胞凋亡的信号相互作用中，钙起着重要作用。通过内质网、线粒体和其他信号通路，ca2+稳态改变与启动细胞凋亡性死亡密切相关[1，2]。ca2+稳态的调节极其复杂，至今还未明了。近年来研究表明，在控制ca2+稳态的过程中更精细的变化可能对决定细胞生死有深刻影响[3]。ca2+稳态可能是凋亡的基本致病过程中的一个药理靶标。
l型ca2+通道在海马锥体神经元基底树突和胞体都特别集中，其电流占细胞总钙电流的30%～50%。它们的开放和关闭能有效调节细胞浆内ca2+的水平，而且有证据表明它们还能将钙信号直接传至细胞核[3，4]。l型ca2+通道的激活可以直接调控一些对神经元存活及其功能所必需的重要基因的表达，如bcl2和脑源性神经营养因子等[5]。
脑心清(nxq)及其有效成分柿叶黄酮(fldk)都具有抗脑缺血损伤作用[6],通过上调抗氧化基因bcl2的表达，改善神经细胞氧化还原状态，清除自由基、抗脂质过氧化等方面来发挥其抗缺氧缺血性神经损伤、抗氧化应激和抗兴奋性谷氨酸毒性神经损伤、抗急性脑缺血作用，抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，保护缺血再灌注引起损伤的脑组织，并能改善缺血再灌注引起损伤的脑组织神经功能[6，7]。本文研究脑心清及其黄酮成分对海马锥体神经元l型ca2+通道活性的影响，以探讨在ca2+稳态调节方面，脑心清及其黄酮成分抗脑缺血损伤神经保护作用的机制。
1 实验材料
1.1 受试药
脑心清片用干浸膏(以下简称脑心清、nxq)，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。
脑心清黄酮(fldk)，由脑心清经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量77.35%，其中槲皮素类含量34.625%，山柰酚类含量为42.50%(hplc测定),代号fldkp70。用2% nahco3 溶液加热到80 ℃溶解成含药25 mg/ml的热溶液。
实验所用溶液的ph均用hcl 和naoh溶液调至7.2～7.4,并用0.22 μm的滤膜过滤除去尘粒和细菌。室温保存，用时加pbs稀释至所需浓度即可。
1.2 药品与试剂
阿拉伯糖胞嘧啶、dna酶ⅰ、2巯基乙醇、mem(modified eagle medium)合成培养基、dhanks 平衡盐干粉、dmem培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、l谷氨酰胺、多聚赖氨酸(mw70150kd)均为美国hyclone公司产品。rnase a(sigma):以1 mg/ml的水溶液,经100 ℃煮沸以灭活dna酶活性后,分装冻存于-20 ℃备用。
1.3 大鼠
新生sd乳鼠,24 h龄，体质量约5.5～10 g，清洁级，合格证号：粤检证字第2003a053号，南方医科大学实验动物中心提供。
1.4 主要仪器
leica dmlfs倒置显微镜、mo203微电极操纵器(mo203，日本)、axopatch 200b型膜片钳放大器(美国 axon instrument)。
2 实验方法
2.1 新生乳鼠海马神经元的原代培养[4]
无菌条件下，借助于解剖显微镜，取刚出生24 h内的sd乳鼠，分离海马组织，用0.25%胰蛋白酶和0.2%脱氧核糖核酸酶pbs溶液37 ℃孵育消化20 min,并不断摇动,用3倍体积的dmem培养基分散和冲洗,消化的细胞经200目细胞筛过滤后，200×g离心5 min,用血球计数板计数细胞,0. 4%台盼蓝镜检存活率大于95%，以1.5 × 105个/ml的密度种植于涂有多聚赖氨酸(10 μg/ml)的24孔培养皿内,每孔0.4 ml,完全培养基为45% dmem+45% f12+10%胎牛血清的混合液,内含青霉素(100 iu/ml)和链霉素100 μg/ml。正常糖培养液： 含5 mmol/l葡萄糖的完全培养基。在一定湿度的37 ℃恒温的培养箱(5%co2)培养48 h，换培养基去除死细胞，加入终质量浓度为10 μg/ml的阿糖胞苷培养48 h，抑制非神经元细胞生长。然后隔48 h换半量新培养基，继续培养12 d，进行钙通道活性测定。
2.2 膜片钳技术测定海马神经细胞l型ca2+通道电流[8]
2.2.1 l型钙通道全细胞钙电流记录的液体配制 细胞浴液(mmol/l)：choline chloride 75; teacl(氯化四乙铵，tetraethyl ammonium tea)50;bacl2 5; cscl 5;hepes 10; mgcl2·6h2o 2;dglucose 10;ttx(河豚毒素，tetrodotoxin) 0.001。用teacl调ph 至7.3。电极冲灌液(mmol/l)：csmeth 145; teacl 10; egta 10;mgcl2·6h2o 5;hepes 10; cacl2·2h2o 1;mgatp 5;leupitin 0.1;用csoh调ph 至7.3，过滤除菌，避光保存。
2.2.2 记录用玻璃微电极的制作 用无芯硬质玻璃毛细管坯(gg15，中科院上海生理所)在垂直微电极拉制仪(p97拉制器)上用两步法拉制。在其尖端涂布ntrimethylsilydiethylamine，并进行热抛光。电极尖端直径约为1 μm，内灌电极液后，全细胞记录的电极冲灌电极液后入细胞浴液的电极电阻在2～5 mω为佳;内插泛极化氯化银与膜片钳放大器探头相连。
2.2.3 全细胞式膜片钳记录[10] 将载有海马神经元的载玻片从培养板中取出,在每次实验前均用记录浴槽内的溶液冲洗带有神经细胞的载玻片，以洗去细胞表面上的其他成分，然后置于含有培养液的膜片钳测定专用平台液槽中，加1 ml浴液，实验仅选用状态优良的锥体细胞(贴壁良好、有明显突起、细胞边界清昕、胞浆均匀一致)。
在显微镜下找到优良的单个神经元细胞，通过倒置显微镜和微电极操纵器监视，驱动微电极接近细胞。当微电极尖端刚刚接触到细胞时，稍加负压，使之与细胞膜形成高达10 gω以上的高阻密封即刻形成。
在贴附式基础上，实验中仅选用密封电阻大于5 gω的细胞。再施以负压吸破细胞膜，形成全细胞记录状态,根据需要对串联电阻和电容进行补偿，再进行记录即为全细胞记录[10]。用l型钙通道特异性阻断剂硝苯地平(nifedipine)和开通剂bay k 8644鉴定所记录的电流为l型钙通道电流。前置放大器的低通滤波设置 1 khz。用 axopatch 200b型膜片钳放大器，调用pclamp软件的clampex程序，由此发出去极化脉冲波，同步采集通道开放电流，一次采集50条曲线存入硬盘。记录时，钳制电压-40 mv施予150 ms,0 mv去极化脉冲，记录ica,l。并给予-70～60 mv的系列去极化脉冲，去极化步距为10 mv，记录钙电流，以各电流幅值对相应电位作图得i-v相关曲线。
2.3 实验分组与药物处理
药物以高浓度溶解在电极液中，实验时加5～20 μl到神经细胞孵育液中，使达到所需浓度。分组：①正常对照：给予溶媒对照。②给药组: 脑心清、fldkp70 、槲皮素、芦丁，剂量分别为5.0、10.0、20.0 μg/ml。
测定记录正常和给药条件下的海马神经细胞l型ca2+通道活性的有关参数，记录在电脑软件上。实验在(25±1)℃温度下进行。
2.4 资料分析
全细胞记录的结果可用clampfit软件直接分析。
2.5 统计学处理
数据以(±s)表示,采用非配对t检验，p<0.05为差异有显著性。patch数用n表示。
3 结 果
3.1 海马锥体神经细胞全细胞l型钙通道电流特性
正常海马锥体神经细胞l型钙通道多显短暂性开放,在记录时间里,无明显的通道时间依赖性失活;当钳制电压vp为-40 mv时,可见一定的内向电流。不同钳制电压下，有不同的电流值,能被bay k 86444激活，并且被硝苯地平完全抑制。当vp=-10 mv时，l型钙通道电流ica,l峰值,电流幅度平均值为(-192.7±46.2)pa，见图1、表1。
3.2 脑心清及其黄酮对海马神经元全细胞l型钙通道电流幅度的影响
脑心清及其黄酮fldkp70 、槲皮素对海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流幅度的影响见表1、图1-3。表1 脑心清、柿叶黄酮和槲皮素对大鼠海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流的影响注:*vp=-10 mv时，药物处理各组ica,l峰值(电流幅度平均值);与对照组比较:*p<0.05;**p<0.01
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，并呈浓度依赖性增加，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%,可使ica,l的iv相关曲线下移，在不同钳制电压下电流幅度均有增加，但没有电压依赖性特征(不改变i-v相关曲线的形状)，也不改变钙通道的电学特征(最大激活电位在10 mv附近也未改变)，见图1-3和表1。提示它们对海马锥体神经细胞l型钙通道有激活增强作用，并且这种激活是在钙通道结构和功能没有受到破坏的情况下激活。
对海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流最大幅度增强作用的强度从大到小顺序为槲皮素>柿叶黄酮>脑心清。
4 讨 论
中枢神经系统神经元上存在l、n、p、q、r、t等6种类型的电压依赖型钙通道,它们各自有不同的电生理学特征[3]。本实验由于细胞外液中的ttx选择性地阻断了钠通道，外液中的tea和电极内液中的cs+选择性地阻断了钾通道，所记录到内向电流为钙电流。其开放动力学特征与文献报道高电位激活电压门控性钙通道有相似的电学特征性[3]，是典型的l型钙通道。
近年来，传统的兴奋性毒性所致的ca2+超载学说也受到挑战。虽然细胞凋亡时，大多数情况下，细胞内钙离子浓度是增高的，而且这可能是凋亡中的某些环节所必需[9]。但是，另一方面，通过多种途径提高细胞内钙离子浓度又可以减轻培养的神经元细胞的凋亡，如在培养基中加入低浓度的n甲基d门冬氨酸(nmethydaspatrate，nmda)[10],激活电压门控的钙离子通道[1]等措施。
实验发现：在培养的交感神经元，抑制神经元凋亡的钙离子水平为180～240 nmol·l-1[17]，这比在许多细胞中引起细胞中毒的钙离子浓度水平(>5 μmol·l-1)[11]要低得多。年青的、生长因子依赖性很大的交感神经元，其细胞内钙离子浓度比对生长因子依赖性很小的年老交感神经元细胞内钙离子浓度要低。johnson em 等因此提出了一个神经细胞的存活和轴突的生长依赖于细胞内一个适宜的钙浓度的钙调定点学说[1]。认为细胞可能主要有3个不同的钙离子状态：(1)低钙离子状态，此时神经元有凋亡的危险，其存活对生长因子高度依赖;(2)中等浓度钙离子状态，适合细胞的生存，对生长因子的依赖性很小;(3)高钙离子状态，具有细胞毒性[11，13]。
据钙调定点学说，可以推测缺血后谷氨酸受体(glutamate receptor，glur2 /glurb) 表达下调引起钙离子内流，可能具有细胞保护作用;而且，近年来的研究也表明，短暂的前脑缺血3 d后，细胞内钙离子浓度没有增高，并且电压门控钙通道电流是降低的[14]。koh jy 等报道，皮层神经元持续暴露于电压门控钙离子通道拮抗剂中，或者降低培养基中钙离子浓度都能引起细胞凋亡，这与钙调定点学说一致[15]。
nmda本身也可以减少细胞凋亡，而nmda受体拮抗剂类药物则能增加培养细胞和发育中的啮齿类神经细胞的凋亡。这些结果表明nmda受体拮抗剂类药物对缺血性脑损伤的治疗可能具有双刃剑的效果：一方面可降低由于钙超载引起的兴奋性神经元的坏死; 另一方面则可加重其他细胞内的钙离子缺失而引起细胞凋亡[16]。
李晓明等发现对缺血特别敏感的海马ca1区锥体神经细胞l型钙通道活性在脑缺血再灌流早期呈瞬时升高(电流增大、开放概率和频率上升)，而在再灌流后期和晚期却持续性降低(电流减小、开放概率和频率下降)，即先激活后抑制，而对缺血不敏感的海马ca3区神经元则无此现象。此外，海马ca1区锥体神经细胞l型钙通道活性可被细胞外氧化还原状态所调节。细胞外处于高氧化的状态时，l型钙通道活性明显受抑制，细胞外处于高还原的状态时，l型钙通道活性受激活(电流增大)，这在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上呈得更明显。抗氧剂在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上能更显著地增大全细胞l型电压敏感钙通道电流。提示缺血后晚期l型电压敏感钙通道的抑制可能是由于通道被氧化所致，且这种抑制可能与自由基参与海马ca1区锥体神经元缺血性神经元迟发性死亡的机制之一[17]。
总之，虽然钙超载和钙缺失是两个相反的状态，但缺血后的不同时间和不同区域，两种情形都可出现，兴奋毒性的钙超载可能主要出现于缺血早期和缺血中心区，而钙缺失和细胞凋亡可能主要出现在缺血后期和缺血边缘区。不同时间和不同区域，不同的损伤程度细胞内的钙离子浓度水平不一样，其细胞命运也不一样。可见细胞内钙的水平与缺血性神经元损伤的关系相当复杂[1，11]。
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清均能增加海马锥体神经细胞l型钙通道的电流幅度，提示它们对海马锥体神经细胞l型钙通道有激活增强作用。作用强度柿叶黄酮大于脑心清，提示黄酮类是其增加l型钙通道电流的主要活性成分。
脑心清所含黄酮类和酚酸类成分是其抗脑缺血神经保护的重要活性成分。黄酮类成分和酚酸类成分是天然抗氧化剂，能改善细胞的氧化还原状态和促进细胞抗氧化基因表达[7]，将有助于维护l型电压依赖性钙通道的正常功能，这对缺血再灌注时缺血敏感神经元的存活有重要保护意义，可能是脑心清抗脑缺血损伤的药理机制之一。但脑心清及其黄酮成分对l型电压依赖性钙通道的作用是直接激活，还是通过改变细胞外氧化还原状态而激活，还有待进一步研究。
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