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参考范文:
摘要:微生物实验室中的菌种管理工作是一件非常重要的工作环节,对微生物实验结果的影响具有非常重要,为提高实验室的工作质量、加强对微生物菌种的保管质量,根据相关工作经验和调查结果对现有的实验室菌种保存及管理模式进行改进,从而形成一个科学、规范、合理的微生物实验室菌种复苏、传代、保存体系是一件非常重要的事情,从而促进我国微生物实验精确度提升,增强相关工程管理质量的规范程度,为我国医药行业发展及生产质量提高创造良好的条件。
关键词:菌种复苏;传代;保存
微生物实验是我国建筑医药研发及生产的重要环节,是确保我国医药研发行业发展的关键基础。根据药典中的标准,微生物实验室对于新引进的培养基需要通过灵敏度测试后才能投入使用;另外,在对无菌实验成果进行检查时需要使用金黄色葡萄球菌作为对比参照,而在对日常灌装环境质量检测时需要使用环境菌进行辅助检验。由此可见,菌种为微生物实验中非常关键的因素,所以必须要建立起一个科学、健全的微生物实验室菌种的复苏、传代及保存体系。
1用具与设备
接种环,接种针,酒精灯,电热恒温培养箱,生化培养箱,冰箱,灭菌柜,超净台,液氮罐,超低温冰箱,1.5mL冻存管,试管等。
2菌种的复活
应在环境洁净度D级下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染,制备F1,(接收到合适菌种准备使用时,应根据菌种/细胞株的说明书制备复活的培养基对标准菌株、细胞株进行复活。清洁安瓶(可用75%乙醇)后,用砂轮在安瓶的上部1/3处划线,用干燥的无菌纱布包裹安瓶,将安瓶打开。用一无菌吸管吸取0.5-0.8mL适量的液体培养基(生抱梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基;大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、短小芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽抱杆菌用胰酪大豆胨液体培养基;白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖液体培养基)滴加到安瓶中,轻轻旋转安瓶并吹打,使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解,再将安瓶内的菌液转移至相应的培养基中,根据菌种类型将其放入适宜的培养条件[需氧菌培养温度(30-35)℃,18-24h;真菌培养温度(20-25)℃,3-5d下培养,观察培养基是否浑浊,浑浊说明菌种复活生长,此为F1,如不浑浊,需氧菌应延长培养时间至5天以上,真菌应延长培养时间至7d以上,仍不浑浊,按121℃,30min条件火菌处理,再对复活后的标准储备菌株进行纯度和特性的确认。
3菌种的传代
菌种是微生物实验中的重要辅助工具,所以其质量非常重要,每一个菌种在使用前都需要进过严格的测评才能投入实验中。微生物实验是一项对严谨性和精确性要求非常高的工作,所以对于试验中要用到的每一类菌种的复苏、传代和保存都有一套非常严格的标准及原则,已经透过严格检定、确定与相关条件相吻合的菌种才能执行传代步骤。另外,传代工作流程在实际操作时也有非常严格的要求,传代次数不宜过多,且要减少不必要的传代工作,同时还要对传代时的温度进行合理调控。
4菌种的保藏
在菌种的复苏及传代工作完成后,实验室中的菌种管理工作体系已经进入最后一个环节,这一环节同样是保证菌种质量及功效的重要步骤。而在实验室的当中对菌种进行保藏的方法有很多,下面笔者就对几种实验室中常见的菌种保藏方法进行简要阐述。
4.1甘油冷冻管保藏法
甘油冷冻管保藏发是在实验室中一种非常常用的保藏手段,该方法的具体操作方法是使用无菌接种环对菌种表面的菌苔进行刮取,然后利用接种环接触试管的方式使细菌通过与试管壁的轻度摩擦向事先准备好的放置于试管内部的无菌蒸馏水中传输,或直接将菌放置于培养基当中,同时还要对菌液的浓度进行调节,然后在调配完成后的菌悬液中添加体积相等、浓度标准是30%的无菌甘油,从而得出15%的甘油菌悬液。在操作过程中要保证所使用的甘油浓度保持在一个较低的程度,如果甘油浓度高于实验标准将会造成细菌细胞渗透压力产生变化,最终导致细菌发生死亡的问题。在细菌传导完成后需要对试管进行振动和摇荡,在摇时要注意对力度的控制,让试管内的各种物质达到充分融合,再将融合后的溶液分别放置于无菌小试管中,最后将制作完成的甘油冷冻管放入-20℃的低温环境中进行预冻处理,并将其放在低于-80℃的超低温环境中存放,且要保证冰箱的温度至少为-30℃,其在这种冷冻环境下通常能够保留的时长为2a,而乙型溶血性链球菌对保存温度的要求较高,在超低温环境下该菌种的可保存时长为3个月。
4.3斜面低温保藏法
斜面低温保藏法是一种过渡性较强的保藏方法,其保藏时间较短,该方法是通过将菌种转移至条件合适的试管培养基上,或将其转接在茄子瓶的固体培养基斜面上进行培养,在菌种成长到一定程度之后再将其放入2-8℃的温度环境中进行保存。而微生物菌种的类型不同,其保存时间长短也会有所差别。然而,这种保藏方法有一个非常突出的劣势特点,就是采用这种方式进行保存的菌种极易发生状态改变,如果菌种发生变异会对其后期传代效果造成影响,使菌种受到污染。所以,这种方法只能在需要保藏时间较短的菌种类型的保藏工作中使用,并且还要对菌种的保藏状态进行随时检查。
4.4液氮超低温保藏法
4.4.1制备菌悬液
将需要保藏的菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,适宜温度培养,当菌落健壮地长满斜面时取出。配制30%的甘油溶液进行121℃下高压火菌30min,将生长良好的菌种斜面用生理盐水制成菌悬液,菌浓度控制在107左右,然后加入等体积甘油水溶液混匀后制成15%的甘油菌悬液。
4.4.2分装菌悬液
把购买的1.5ml的塑料冻存管拧松管帽置一烧杯中,外扎纱布、牛皮纸包扎好进行121℃高压火菌30min。然后将制备好的菌悬液分装至1.5mL的塑料冻存管中,每支冻存管加入1mL菌悬液,拧紧管帽,并用胶布封口,分别在胶布和冻存管上做好菌种标记。
4.4.3液氮保藏
将菌液保持在0摄氏度的状态,然后将有关设备放置到零下70摄氏度左右的冰柜立面,然后进行降温。接着将相应的冻存管放入到液氮罐妥善的保存,并且在罐的外面做好详细的标记工作,为以后使用菌种带来方便。当液氮中所存在的菌种需要复苏时,这时操作人员就应当将菌种提出来,放置到大约35-40摄氏度的环境里面进行充分的搅拌,从而达到解冻的目的。为了避免菌种出现污染的情况,操作人员需要用75%的酒精进行擦拭,当表面完全干燥以后就可以使用相应的容器将菌液按种到相应的培养基上做好培养工作。
结束语
综上所述,对微生物实验室中的菌种进行保存的方法有很多种,这些方法的正确使用对菌种的保存质量的提高具有积极作用。然而,若方法使用不合理使菌种的保存质量严重降低,不但无法达到有效提高菌种保存效果的目的,还会造成适得其反的结果,因此一定要建立起科学规范的菌种复苏、传代和保存体系,这样才能有效提高菌种保藏的科学性和规范性,以促进微生物实验室检验效率的提高,增强实验结果的精确性,为微生物实验工作的完善奠定基础,从而推动该行业在我国快速发展。
参考文献
[1]王燦.微生物实验室菌种管理和使用经验探讨[J].生物技术世界,2015(1):8-8.
[2]陈晓燕,林光.微生物实验菌种保存方式探讨[J].临床合理用药杂志,2014(29):129-130.
1.生物化学实验教学投入不够:
湖南理工学院生物工程专业为2005年新设专业,一切从零开始,实验设备不够,无法满足现代生物化学实验教学要求。实验设备台套数不够,限制了学生单独操作实验设备的可能,例如层析系统、常压色谱仪和高效液相色谱仪各一台,很难让每位学生单独操作。
2.生物化学实验教学内容陈旧:
由于生物化学实验教学经费投入有限,生物化学实验设备单一,导致生物化学实验内容设置只能以验证性实验为主。比如运用分光光度计测定物质的含量,设置的内容太多,几乎一半实验均需要使用分光光度计。这样的实验内容设置,根本无法满足学生对生物化学基本理论、基本概念的理解,更谈不上能力的培养。
3.教学过程中学生参与性不强:
实验前预备室教师做好一切准备工作。课堂上实验教师先召集学生讲解操作步骤等等。然后学生按照实验教师的讲解一步一步完成实验内容。实验完成后,教师指导学生处理实验结果,分析实验问题。一切均由实验指导教师包办。学生不用思考,只需要机械地完成一切,久而久之,学生不再思考,更谈不上在实验过程中发现问题和解决问题。如此教学方式,必将影响学生对实验课的兴趣,不利于学生能力的培养。
二、生物化学实验教学改革内容。
针对上述问题,湖南理工学院在多方面采取对策,对生物化学实验教学进行了改革,具体改革内容如下:
1.加大生物化学实验教学投入。
加强实验室基本建设,首先从实验场地建设入手,学校加大实验场地建设,为生物工程专业建设了大量实验室,保证了实验教学场地,目前建立了包括生物化学实验分室在内的大量实验分室。在进行场地建设的同时,连续多年对生物化学实验教学仪器进行投入,购置了包括5台液相色谱仪在内的大量实验教学仪器,使生物化学实验教学内容改革成为可能。近几年来,湖南理工学院不仅在实验室硬件建设方面增加了财力投入,同时在实验室人员配置上也投入人力,把教学能力强的教师配置到实验教学上,把实验教学放在一个前所没有的高度进行建设。
2.改革生物化学实验教学内容。
生物工程专业在改革前生物化学实验40学时,实验内容主要以验证性实验为主。通过改革,把生物化学实验从40学时调整为96学时,把实验教学内容将生物化学实验调整为以验证性实验为基础,以综合性实验和设计性实验为主要教学内容,重点突出综合性实验和设计性实验的实验教学内容设置,以此为基础进行生物化学实验教学。结合教师专业方向特点,我们在生物化学综合性和设计性实验设置上主要以生物大分子的分离提纯与活性测定为主。事实证明,综合性和设计性实验的开设,激发了学生的学习与研究热情,越来越多的学生主动申请进入教师课题组从事科学研究工作。考虑到学生的学习热情,我们在改革生物化学实验教学内容的同时,结合学院每位教师的科研工作,开设了生物化学创新性实验,以期学生获得进一步提高。比如2011级生物工程专业生物活性镇痛肽的合成与活性研究课题小组,在该文作者的指导下,通过Fmoc固相多肽合成、高效液相色谱纯化、复性体系二硫键形成等方式合成生物活性多肽,将活性多肽在动物模型上进行镇痛活性研究,发现合成的镇痛多肽在动物模型中具有良好的镇痛活性,该实验结果通过该文作者整理,发表在SCI杂志“Protein&PeptideLetter”杂志上。通过创新性实验开设,学生解决问题的能力越来越强。为本科生将来进入实验室从事研究工作实现无缝对接打下了坚实基础。
3.改革生物化学实验教学方式。
传统生物化学实验教学由教师主导,学生被动接受,学生缺乏主观能动性,缺乏参与性。目前我们通过改革,将教师从主导地位改为从属地位,而学生则从从属地位变为主导地位,教师只安排实验项目,也就是出题。学生则从实验设计、实验准备、实验过程到实验结果分析全部自己解决,并且每次实验完成后学生均应该能够提出问题,教师则和学生探讨实验问题,学生的实验操作技能和实验成功率得到了极大提高。同时也使学生了解了一个实验的全部内容,为学生研究性学习,为学生将来进入社会参与工作或者将来从事研究工作打下坚实基础。
4.改革生物化学实验考核方式。
针对传统生物化学实验只注重实验理论考试和期末实验考试的做法,湖南理工学院采用全程考核的方式对生物化学实验进行全程考核,也就是实验的全过程都是考核过程。对每位学生生物化学实验成绩的评定,采用平时实验成绩、实验报告和实验考试成绩相结合的办法。平时实验成绩占比50%,平时实验成绩根据每位学生每次实验的准备情况,实验过程中各种仪器设备操作规范性,实验结果的准确性,甚至包括实验过程中试剂称量、溶液配制等实验习惯性动作进行综合评定,每次实验完成现场给出平时成绩;实验报告占比20%,实验报告的撰写是学生对自己实验过程以及实验结果的重要总结,体现学生分析归纳总结能力,同时也是对学生将来从事研究工作,撰写研究论文和研究报告的重要训练,故有必要将实验报告的撰写考核单独列出,予以评分,使学生重视实验报告的撰写;实验考试成绩占比30%,实验考试成绩和传统实验考核一致,但比重显著下降,实验笔试成绩占实验考试成绩的20%;实验操作考试占实验考试成绩的80%。通过实验考核方式的改变,督促学生在生物化学实验过程中全身心投入,认真对待每一次生物化学实验,认真对待每一个实验的全部细节,认真做好每一个生物化学实验。由于考核方式的改变,只有那些从头至尾认真对待生物化学实验的学生才有可能获得高分,大大调动了学生对生物化学实验的积极性和主动性。
2.多媒体课件制作的技术支撑及风格定位。常用的多媒体课件制作软件包括PowerPoint、Authorware、Flash、Photoshop等,在制作设计风格上以“和谐统一、各具特色”为总方针,根据主体内容的特点选择不同的展示风格。所谓“和谐统一”主要表现在界面的整体规划与设计方面,包括模板选择、内容编排、文本格式和色彩的搭配等。课件统一采用白色背景模板,主体内容与框架结构编排一致,统一字体格式及页面布局,色彩搭配上以易于阅读和重点突出为主,使用背景与字体对比鲜明的颜色,如浅色背景配黑色或深红、绿、蓝色字体。而“各具特色”主要由于实验原理、仪器和实验结果等的不同,在图片、图表、动画或视频的选择上呈现差异。如酶活性实验的结果分析部分,采集学生的实验结果图片,通过实验结果的直观对比,说明不同组间在实验现象上可能出现差异,而不同的实验现象均能用同样的理论来进行解释,通过图片的对比分析,加强学生对实验原理的理解,同时提升学生分析问题和解决问题的能力。在仪器介绍和实验原理讲解部分,课件主要采用动画或视频进行演示,给学生最直观的感受,易于学生的理解和掌握。
3.多媒体课件的素材采集及编制。根据动物生物化学实验涉及的研究方法和研究对象,通过实验教学及网络资源两种方式进行课件所需图片、图表、动画和视频等资料的采集,再利用多媒体制作软件将这些素材与课程内容有机结合,通过静态文本、动画和视频演示等多种形式制作成适合实验项目的多媒体课件。如仪器介绍部分、移液器、离心机等常规仪器充分利用网络视频进行仪器结构、使用方法及注意事项的讲解,节约了制作成本;而分光光度计由于型号不同、使用方法存在差异,主要通过图片呈现和自行制作的动画来介绍使用流程。实验操作步骤部分,根据操作的难易分别采用图片、图表或视频等方式,如凝胶过滤法分离蛋白质实验,由于学生初次接触该类实验方法相对陌生,从而选用相关的网络视频进行操作步骤的演示,有助于学生对实验全程的了解及细节的掌握。同时,课件还利用制作的动画模拟介绍实验技术的基本原理,如在聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG实验中,聚丙烯酰胺不连续系统电泳产生浓缩效应的原理较难理解,课件制作了相关的动画,形象生动地展示更易于学生对知识的消化和吸收。
二、动物生物化学实验多媒体课件的教学效果分析
本实验室自2008年就开始利用多媒体技术进行动物生物化学实验教学,该多媒体课件也历经了5年时间的补充和完善。以2013级华南农业大学动物科学专业、水产养殖专业、蚕学专业的学生为调查对象,在229名本科生中随机选择了112名学生进行了多媒体教学效果的问卷调查,表1给出了本课件教学效果的综合统计结果。从反馈信息的综合分析结果可以看出,学生广泛认同多媒体技术适用于实验教学,且比传统板书的教学效果好,有助于教学内容的讲解,同时通过图文并茂以及生动直观地展示,提高了学生的学习兴趣,有利于学生对知识的理解和实验技能的掌握。在多媒体课件的制作效果上,约93.75%的学生对现有的课件表示满意,这说明课件在总体上很好地满足了教学要求。
三、动物生物化学实验多媒体课件存在的问题及对策
1.96.43%的学生认为单个实验多媒体讲解的适宜时间应控制在30分钟以内,因此在实验编排及讲解上应条理清晰,重点突出。通过调查笔者发现该课件仍有需要改进的地方。
2.58.04%的学生表达了对增加教学视频的愿望,说明包含听觉和视觉信息的视频教学方式,有利于激发学生的学习兴趣,使学生在视听的交互作用下强化接收信息的能力,拓宽了学生思维和想象的空间。
3.22.32%的学生认为课件在版面设计方面需要调整,通过对课件的总体检阅,笔者发现部分章节存在文字较多的现象,对这些内容将本着“内容精简,行间稀疏”的原则进行调整,同时丰富课件的色彩及插图,使课件不仅具备技术性和实用性,同时具有较强的整体美感。
4.19.64%的学生觉得课件框架需要调整,这反映出学生在对所学知识尤其是部分章节教学重点和难点的理解上仍存在一定的困难,因此课件后期的调整应加大这部分内容素材的收集、完善以及整理,通过动画或视频等形式帮助学生对知识重点和难点的消化和吸收。
从2010级中西结合专业随机抽取4个班,每班各随机抽取50人后,随机分为2组,每组25人,其中一组按常规方法进行实验报告的批改,称为对照组,共100人;另一组在学生做完实验并完成实验报告后,老师当面批改实验报告并就实验内容随机提问,称为实验组,共100人。
1.2成绩评定方法
给每个班对照组与实验组学生授课的老师、内容与方式都相同。期末实验完成后进行实验操作与实验理论考试,实验操作考试占50分,实验理论考试占50分,学生实验总成绩分为60~69分、70~79分、80~89分、90~100分4个等级,最后通过比较两组总成绩,分析随机提问式批改实验报告的效果。
1.3统计学分析
使用SPSS17.0统计软件包录入数据,采用秩和检验比较分析两组实验对象成绩的差异。
2结果
所有实验完成后,对学生的实验操作和实验理论各50分进行考核,统计得分情况如表1所示。采用秩和检验分析,Z=-2.999,P=0.003,对照组与实验组学生成绩的差异具有统计学意义,实验组学生成绩较对照组学生成绩有明显提高。